In vitro демонстрация прямого воздействия фермента PCSK9 на тромбоциты

Ключевая роль тромбоцитов во время артериальных ишемических событий, таких как инфаркт миокарда (ИМ), инсульт и смерть от сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), а также значительная роль мощной антиагрегантной терапии в уменьшении этих событий хорошо определены. Была продемонстрирована независимая связь между уровнями PCSK9 в плазме, повышенной реактивностью тромбоцитов и ишемическими исходами у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС). Была высказана гипотеза о связи уровней PCSK9 в плазме с риском ишемической болезни сердца (ИБС), независимо от уровня холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). На основании метаанализа исследований пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями (ССЗ) среднего и высокого риска исследователи продемонстрировали значительное снижение смертности и инфаркта миокарда при применении антител PCSK9 и предположили соответствующую антиишемическую / антиагрегантную роль антител PCSK9. Эти наблюдения подтверждают гипотезу о том, что антиишемические эффекты терапии ингибитором PCSK9 связаны с ее плейотропным действием на тромбоциты.

Исследования in vitro, на животных и людях показали прямое воздействие PCSK9 и ингибиторов PCSK9 на тромбоциты. PCSK9 косвенно активирует тромбоциты за счет повышения уровней LDL-C и oxLDL. oxLDL может активировать тромбоциты путем связывания с рецепторами-мусорщиками CD36 и LOX-1. Кроме того, была предложена прямая связь между PCSK9 и активацией тромбоцитов через рецепторы-мусорщики CD36 и лектиноподобный окисленный рецептор ЛПНП (LOX)-1. Инкубация человеческого рекомбинантного белка PCSK9 с богатой тромбоцитами плазмой, собранной у здоровых людей, значительно усиливала экспрессию активированного рецептора GPIIb/IIIa и агрегацию тромбоцитов, индуцированную субоптимальными концентрациями адреналина. В экспериментах in vitro воздействие рекомбинантного PCSK9 человека усиливало экспрессию LOX-1 в эндотелиальных клетках сосудов и гладкомышечных клетках человека. Аналогичным образом, мыши LOX-1 KO показали более низкие уровни PCSK9, а мыши PCSK9-KO показали гораздо более низкие уровни LOX-1, что указывает на взаимную связь между PCSK9 и LOX-1. Аналогичная реципрокная связь между уровнями PCSK9 и экспрессией LOX-1 и CD36 не была продемонстрирована в тромбоцитах человека.

Эксперименты по иммуноблоттингу in vitro продемонстрировали наличие PCSK9 в тромбоцитах, полученных от пациентов с ИБС, а эксперименты по проточной цитометрии показали, что коллаген-родственный пептид (CP) значительно усиливает поверхностную экспрессию PCSK9 на тромбоцитах. Кроме того, антитела PCSK9 значительно ингибировали АДФ- и СР-индуцированную агрегацию тромбоцитов и тромбоцитарно-зависимое образование тромбов на поверхности иммобилизованного коллагена при высокой скорости сдвига (1000 с-1). Связывание PCSK9 с CD36 запускает активацию тромбоцитов посредством активации никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидазы (Nox)2, высвобождения активных форм кислорода (АФК) и последующей активации рецептора GPIIb/IIIa и высвобождения p-селектина. Кроме того, Nox2 индуцирует выработку 8-изо-простагландина F2α и тромбоксана (Tx) A2 посредством активации цитозольной фосфолипазы A2 и, наконец, приводит к активации рецептора GP-IIb/IIIa и высвобождению p-селектина. Была продемонстрирована связь между PCSK9 в плазме, 11-дегидро-TxB2 в моче и сердечно-сосудистыми событиями у пациентов с фибрилляцией предсердий. Кроме того, отмытые тромбоциты, ресуспендированные в плазме пациентов с семейной гиперхолестеринемией после лечения ингибитором PCSK9, индуцировали меньшую агрегацию тромбоцитов и высвобождение растворимого пептида, производного Nox2 (sNox2-dp), чем те, которые были получены с использованием плазмы до лечения ингибитором PCSK9 в исследовании in vitro. Это снижение было обращено вспять добавлением oxLDL. Кроме того, агрегация тромбоцитов, индуцированная oxLDL, снижалась за счет ингибирования CD36, LOX-1 и Nox2. В том же исследовании было показано, что 6-месячное лечение ингибиторами PCSK9 снижает уровни LDL-C, oxLDL, сывороточных TxB2, sNox2-dp и PCSK9.

Эти предварительные наблюдения позволяют предположить, что:

• Преимущества лечения сердечно-сосудистых заболеваний, связанные с терапией ингибитором PCSK9, могут быть частично связаны с его плейотропным действием на тромбоциты.
• Исследования in vitro, на животных и клинические исследования показали прямое воздействие PCSK9 на тромбоциты.
• PCSK9 влияет на функцию тромбоцитов через активность Nox2, опосредованную рецептором CD36/LOX-1.

Однако потенциальное прямое воздействие PCSK9 на тромбоциты не было продемонстрировано в комплексном исследовании с участием разнообразной популяции здоровых добровольцев и субъектов с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний. Включение как минимум 3 факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний увеличит вероятность обнаружения субъектов с повышенным фенотипом реактивности тромбоцитов и демонстрации усиленного эффекта PCSK9, связанного с тромбоцитами. Наличие этих факторов риска традиционно связывают с увеличением распространенности сердечно-сосудистых заболеваний и связанного с ними риска.

В современных клинических исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний представлен очень низкий процент (<10%) афроамериканцев, несмотря на более выраженный риск сердечно-сосудистых заболеваний. Кроме того, было продемонстрировано, что уровни PCSK9 значительно выше у афроамериканцев по сравнению с европеоидами (104 ± 29 против 95 ± 30 нг/мл соответственно; P = 0,020). В больнице Синай в Балтиморе исследователи сообщили о более высоких показателях ишемических событий после ЧКВ и большей смертности у афроамериканцев, чем у белых. Редкие мутации PCSK9 с потерей функции (LoF) были связаны с низкими уровнями ЛПНП (на 28% ниже у чернокожих и на 15% у белых) и с еще более впечатляющим снижением риска ишемической болезни сердца (ИБС). ) (88% и 47% соответственно). Варианты PCSK9 LoF были связаны со снижением уровня холестерина ЛПНП на 35 мг/дл и 13 мг/дл у афроамериканцев и европеоидов соответственно, а также со снижением риска ишемической болезни сердца на 49% и 18% у афроамериканцев и европеоидов соответственно. В исследовании с участием 10 196 взрослых афроамериканцев из США варианты PCSK9 LoF были связаны с более низкими концентрациями липопротеина (Lpa) и OxPL-apoB. Эти данные указывают на прямую связь между PCSK9 и риском ИБС, а также на важность снижения уровня PCSK9 для снижения риска ИБС среди афроамериканцев.

Знания, полученные в результате нашего поискового механистического исследования, помогут нам понять прямое влияние PCSK9 и ингибитора PCSK9 на тромбоциты и облегчить клиническое применение ингибиторов PCSK9 у широкого круга пациентов с сердечно-сосудистым риском.