Dimostrazione in vitro degli effetti diretti correlati alle piastrine dell'enzima PCSK9

Il ruolo chiave delle piastrine durante eventi ischemici arteriosi, come infarto del miocardio (IM), ictus e morte cardiovascolare (CV), e il ruolo significativo di una potente terapia antipiastrinica nel ridurre questi eventi sono stati ben definiti. È stata dimostrata un'associazione indipendente tra livelli plasmatici di PCSK9, elevata reattività piastrinica ed esiti ischemici in pazienti con sindromi coronariche acute (ACS). È stata suggerita l’associazione dei livelli plasmatici di PCSK9 con il rischio di malattia coronarica (CAD), indipendentemente dai livelli di colesterolo lipoproteico a bassa densità (LDL-C). Sulla base di una meta-analisi di studi condotti su pazienti con malattie cardiovascolari (CVD) a rischio medio-alto, i ricercatori hanno dimostrato una significativa riduzione della mortalità e dell’IM con anticorpi PCSK9 e hanno suggerito un rilevante ruolo anti-ischemico/antipiastrinico degli anticorpi PCSK9. Queste osservazioni supportano l’ipotesi che gli effetti anti-ischemici della terapia con inibitori di PCSK9 siano correlati ai suoi effetti pleiotropici sulle piastrine.

Studi in vitro, su animali e sull’uomo hanno suggerito gli effetti diretti degli inibitori di PCSK9 e PCSK9 sulle piastrine. PCSK9 attiva indirettamente le piastrine attraverso livelli elevati di LDL-C e oxLDL. oxLDL può attivare le piastrine legandosi ai recettori scavenger CD36 e LOX-1. Inoltre, è stata suggerita una relazione diretta tra PCSK9 e l'attivazione piastrinica attraverso i recettori scavenger CD36 e il recettore LDL ossidato simile alla lectina (LOX) -1. L'incubazione della proteina PCSK9 umana ricombinante con plasma ricco di piastrine raccolto da soggetti sani ha migliorato significativamente l'espressione dei recettori GPIIb/IIIa attivati ​​e l'aggregazione piastrinica indotta da concentrazioni subottimali di epinefrina. Negli esperimenti in vitro, l’esposizione al PCSK9 ricombinante umano ha migliorato l’espressione di LOX-1 nelle cellule endoteliali vascolari umane e nelle cellule muscolari lisce. Allo stesso modo, i topi LOX-1 KO hanno mostrato livelli di PCSK9 più bassi e i topi PCSK9-KO hanno mostrato livelli di LOX-1 molto più bassi, indicando una relazione reciproca tra PCSK9 e LOX-1. Una relazione reciproca simile tra i livelli di PCSK9 e l'espressione di LOX-1 e CD36 non è stata dimostrata nelle piastrine umane.

Esperimenti di immunoblotting in vitro hanno dimostrato la presenza di PCSK9 nelle piastrine ottenute da pazienti con CAD, e esperimenti di citometria a flusso hanno dimostrato che il peptide correlato al collagene (CP) migliora significativamente l'espressione superficiale di PCSK9 sulle piastrine. Inoltre, gli anticorpi PCSK9 hanno inibito significativamente l'aggregazione piastrinica indotta da ADP e CP e la formazione di trombi piastrino-dipendenti sulla superficie del collagene immobilizzato ad alta velocità di taglio (1000 secondi-1). Il legame di PCSK9 a CD36 innesca l'attivazione piastrinica attraverso l'attivazione della nicotinamide adenin dinucleotide fosfato ossidasi (Nox)2, il rilascio di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la successiva attivazione del recettore GPIIb/IIIa e il rilascio di p-selectina. Inoltre, Nox2 induce la generazione di 8-Iso-prostaglandina F2α e trombossano (Tx) A2 attraverso l'attivazione della fosfolipasi citosolica A2 e infine determina l'attivazione del recettore GP-IIb/IIIa e il rilascio di p-selectina. È stata dimostrata la relazione tra PCSK9 plasmatico, 11-deidro-TxB2 urinario ed eventi CV in pazienti con fibrillazione atriale. Inoltre, le piastrine lavate risospese nel plasma di pazienti con ipercolesterolemia familiare dopo il trattamento con un inibitore di PCSK9 hanno indotto un'aggregazione piastrinica e un rilascio di peptide solubile derivato da Nox2 (sNox2-dp) inferiori rispetto a quelli ottenuti utilizzando il plasma prima del trattamento con un inibitore di PCSK9 in uno studio in vitro. Questa riduzione è stata invertita con l'aggiunta di oxLDL. Inoltre, l’aggregazione piastrinica indotta da oxLDL è stata ridotta inibendo CD36, LOX-1 e Nox2. Nello stesso studio, il trattamento di 6 mesi con inibitori di PCSK9 ha dimostrato di ridurre i livelli sierici di LDL-C, oxLDL, TxB2 sierico, sNox2-dp e PCSK9.

Queste osservazioni preliminari suggeriscono che:

• I benefici CV associati alla terapia con inibitori di PCSK9 possono essere in parte correlati ai suoi effetti pleiotropici sulle piastrine.
• Studi in vitro, su animali e clinici hanno suggerito effetti diretti di PCSK9 sulle piastrine.
• PCSK9 influenza la funzione piastrinica attraverso l'attività Nox2 mediata dal recettore CD36/LOX-1.

Tuttavia, i potenziali effetti diretti del PCSK9 sulle piastrine non sono stati dimostrati in uno studio completo che ha coinvolto una popolazione diversificata di volontari sani e soggetti con fattori di rischio cardiovascolare. L'inclusione di almeno 3 fattori di rischio CV aumenterà la possibilità di trovare soggetti con un fenotipo di reattività piastrinica elevata e la dimostrazione di un maggiore effetto correlato alle piastrine di PCSK9. La presenza di questi fattori di rischio è stata tradizionalmente attribuita all’aumento della prevalenza di CVD e del rischio associato.

Negli studi clinici contemporanei sulle CVD, è rappresentata una percentuale molto bassa (<10%) di afroamericani nonostante un rischio CVD più pronunciato. Inoltre, è stato dimostrato che i livelli di PCSK9 sono significativamente più alti negli afroamericani rispetto ai caucasici (rispettivamente 104 ± 29 vs 95 ± 30 ng/mL; P = 0,020). Al Sinai Hospital di Baltimora, i ricercatori hanno segnalato tassi più elevati di eventi ischemici post-PCI e una maggiore mortalità negli afroamericani rispetto ai bianchi. Mutazioni rare con perdita di funzione (LoF) di PCSK9 sono state associate a bassi livelli di LDL-C (28% inferiori nei neri e 15% nei bianchi) e con una riduzione ancora più impressionante del rischio di malattia coronarica (CAD ) (rispettivamente 88% e 47%). Le varianti LoF di PCSK9 erano associate a livelli di LDL-C inferiori di 35 mg/dl e 13 mg/dl negli afroamericani e nei caucasici, rispettivamente, e a un rischio inferiore di malattia coronarica rispettivamente del 49% e del 18% negli afroamericani e nei caucasici. In uno studio su 10.196 adulti afroamericani statunitensi, le varianti LoF di PCSK9 erano associate a concentrazioni più basse di lipoproteina (Lpa) e OxPL-apoB. Questi dati indicano una relazione diretta tra PCSK9 e il rischio di CAD e l’importanza di abbassare i livelli di PCSK9 nel ridurre il rischio di CAD tra gli afroamericani.

Le conoscenze acquisite dal nostro studio meccanicistico esplorativo ci aiuteranno a comprendere gli effetti diretti di PCSK9 e degli inibitori di PCSK9 sulle piastrine e faciliteranno l’applicazione clinica degli inibitori di PCSK9 in un’ampia gamma di pazienti con rischio cardiovascolare.