Profilování malých RNA ve vydechovaném vzduchu u sportovců (AirBiopsy)

Pozadí: Kondenzát vydechovaného vzduchu (EBC) je neinvazivně odebíraná biologická tekutina obsahující těkavé a netěkavé sloučeniny včetně malých RNA. Profilování malých RNA v EBC se jeví jako slibný přístup pro identifikaci a vývoj minimálně invazivních biomarkerů plicních onemocnění; metodologické důkazy však zůstávají omezené a heterogenní.

Cíle: Vyhodnotit technickou proveditelnost extrakce malých RNA a sekvenování nové generace (NGS) z EBC a charakterizovat profily malých RNA v klidu a po maximální zátěži s využitím EBC jako modelové matrice pro dynamické fyziologické změny.

Metody: V pilotní studii provedené jako součást institucionálního výzkumu Lékařské univerzity v Białystoku (B.SUB.25.512 a B.SUB.25.529) jsme analyzovali 22 vzorků EBC odebraných zařízením RTube od 11 zdravých dobrovolníků a 3 pacientů s rakovinou plic a současnou CHOPN (GOLD 3-4) v klidu a po standardizované maximální zátěži potvrzené kardiopulmonálním zátěžovým testem (CPET). Celková RNA byla extrahována pomocí komerčního soupravy pro izolaci RNA s vysokou propustností určené pro biologické vzorky s nízkým obsahem nukleových kyselin, soupravy miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit (Qiagen), podle protokolu výrobce s modifikacemi. Knihovny malých RNA byly vytvořeny pomocí vysoce citlivé soupravy pro přípravu knihoven sekvenování malých RNA s nízkým vstupem TrueQuant Small RNA-Seq Library Preparation Kit (GenXPro GmbH) s jedinečnými molekulárními identifikátory (UMI) a sekvenovány na platformě Illumina. Čtení byla zpracována pomocí Cutadapt a FastQC, iterativně mapována na referenční genom hg38 (Homo sapiens) pomocí Bowtie2, zarovnána proti řadě RNA databází včetně miRNA (miRBase), tRNA (GtRNAdb), piRNA (piRNAdb), ncRNA (ENSEMBL) a cDNA (ENSEMBL) a kvantifikována pomocí HTSeq. Analýza diferenciální exprese (DEA) a analýza hlavních komponent (PCA) byly provedeny pomocí DESeq2.