Small-RNA-Profiling in EBC bei Sportlern (AirBiopsy)

Hintergrund: Das ausgeatmete Atemkondensat (EBC) ist eine nicht-invasiv gewonnene Bioflüssigkeit, die flüchtige und nicht-flüchtige Verbindungen, einschließlich kleiner RNAs, enthält. Die Profilierung kleiner RNAs im EBC scheint ein vielversprechender Ansatz zur Identifizierung und Entwicklung minimal-invasiver Biomarker für Lungenerkrankungen zu sein; jedoch bleibt die methodische Evidenz begrenzt und heterogen.

Ziele: Bewertung der technischen Machbarkeit der Extraktion kleiner RNAs und des Next-Generation Sequencing (NGS) aus EBC sowie Charakterisierung der Profile kleiner RNAs in Ruhe und nach maximaler Belastung unter Verwendung von EBC als Modellmatrix für dynamische physiologische Veränderungen.

Methoden: In einer als Teil der gesetzlichen Forschung an der Medizinischen Universität Białystok (B.SUB.25.512 und B.SUB.25.529) durchgeführten Pilotstudie analysierten wir 22 EBC-Proben, die mit dem RTube-Gerät von 11 gesunden Freiwilligen und 3 Patienten mit Lungenkrebs und gleichzeitig bestehender COPD (GOLD 3-4) in Ruhe und nach standardisierter maximaler Belastung, bestätigt durch kardiopulmonale Belastungstests (CPET), gesammelt wurden. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung eines kommerziellen Hochdurchsatz-RNA-Isolationskits, das für biologische Proben mit geringem Nukleinsäuregehalt konzipiert ist, des miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kits (Qiagen), gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Modifikationen extrahiert. Kleine RNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung des hochempfindlichen, niedrig-input TrueQuant Small RNA-Seq Library Preparation Kits (GenXPro GmbH) mit Unique Molecular Identifiers (UMIs) erstellt und auf einer Illumina-Plattform sequenziert. Die Reads wurden mit Cutadapt und FastQC verarbeitet, iterativ auf das hg38 (Homo sapiens) Referenzgenom unter Verwendung von Bowtie2 abgebildet, gegen eine Reihe von RNA-Datenbanken, einschließlich miRNA (miRBase), tRNA (GtRNAdb), piRNA (piRNAdb), ncRNA (ENSEMBL) und cDNA (ENSEMBL), ausgerichtet und mit HTSeq quantifiziert. Die differentielle Expressionsanalyse (DEA) und die Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurden mit DESeq2 durchgeführt.