Zkoumat, zda Harvester® zlepšuje pohyblivost spermií a využití blastocyst (procento oplodněných vajíček, která se vyvinou do stadia, kdy je možné je transferovat) v cyklech IVF.

PODROBNÝ POPIS Vědecké pozadí a zdůvodnění Neplodnost postihuje 10–15 % párů na celém světě, přičemž mužské faktory přispívají téměř k polovině případů. Příprava spermií je klíčovým laboratorním krokem v asistované reprodukci (ART), který přímo ovlivňuje klinické výsledky nad rámec základní kvality semene. Denzitní gradientová centrifugace (DGC) a plavání nahoru (swim-up) byly po desetiletí převažujícími technikami přípravy spermií, ale obě metody jsou pracné, vyžadují více kroků a mohou způsobovat rozdíly mezi laboratořemi kvůli faktorům závislým na technice.

Fragmentace DNA a selekce spermií Klinická výhoda moderních metod separace spermií spočívá v redukci fragmentace DNA spermií. Metaanalýzy mikrofluidní selekce spermií prokazují významné zlepšení fragmentace DNA (průměrný rozdíl -9,98 %, p<0,00001), progresivní motility (průměrný rozdíl +14,50 %, p=0,04) a míry oplodnění (OR 1,22, p=0,04). Klíčové je, že tyto zisky jsou nezávislé na základních parametrech semene, což naznačuje, že volba metody přípravy může kompenzovat špatný výchozí materiál – což je zvláště relevantní pro populace s těžkou oligospermií.

Progresivní motilita jako náhradní biomarker Progresivní motilita slouží více než jen jako funkční měřítko; funguje jako náhrada za genomovou integritu spermií a predikuje vývojovou trajektorii embrya. Vysoce pohyblivé spermie spolehlivě vykazují nižší fragmentaci DNA, lepší organizaci chromatinu a optimalizovanou mitochondriální funkci. Publikované důkazy ukazují, že vyšší progresivní motilita po přípravě významně zvyšuje míru tvorby blastocyst v cyklech ICSI (42,7 % vs 28,2 %, p=0,015), a motilita úzce koreluje s oplodněním (p=0,012), těhotenstvím (p=0,001) a mírou živě narozených dětí (p=0,001) u IVF.

Těžká oligospermie jako zvláštní klinická výzva Multicentrické studie ukazují, že muži s těžkou oligospermií (<5 milionů/ml) čelí o 12–15 % nižší míře oplodnění a o 18–22 % nižší míře blastulace, a to i po úpravě na věk ženy a další proměnné. Jejich spermie také vykazují horší fragmentaci DNA a kvalitu chromatinu, což vytváří odlišný patofyziologický stav, který může mít diferenciální prospěch z pokročilých technologií selekce spermií.

Design studie a metodologie Architektura studie Jedná se o prospektivní, multicentrickou, randomizovanou (1:1), paralelní, studií s designem nehorší se zaslepením PGT-A laboratoře. Studie porovnává mikrofluidní zařízení pro přípravu spermií SwimCount Harvester s převažující standardní metodou péče na každém místě ve 15–25 centrech IVF s vysokým objemem. Místa, kde DGC nebo swim-up tvoří ≥90 % standardní praxe, budou tvořit primární analytickou kohortu; místa již používající mikrofluidní zařízení jako standard péče budou analyzována exploratorně, aby zachytila reálnou rozmanitost.

Popis zařízení a mechanismus SwimCount Harvester (MotilityCount ApS, Kodaň, Dánsko) je zdravotnický prostředek třídy II schválený FDA 510(k) (K241348, leden 2025) a označený CE (EU MDR 2017/745) pro přípravu spermií v asistované reprodukci. Zařízení využívá mikrofluidní, membránou zprostředkovanou selekci motility: pohyblivé spermie procházejí mikroporézní bariérou ze zásobníku vzorku do komory pro sběr během 30–60minutové inkubace při 37 °C. Tento pasivní selekční proces izoluje spermie s vyšší progresivní motilitou a nižší fragmentací DNA bez mechanického stresu centrifugace. Dostupné v kazetách o objemu 1 ml a 3 ml je zařízení na jedno použití a vyžaduje minimální technické školení (1–2 hodiny).

Randomizace a alokace Účastníci jsou randomizováni v den odběru oocytů po potvrzení způsobilosti a předběžné analýze semene (objem, koncentrace, progresivní motilita). Randomizace využívá permutované bloky proměnné velikosti v rámci místa s alokací 1:1 k Harvesteru nebo standardní péči místa. Utajení alokace je udržováno prostřednictvím elektronického systému Sealed Envelope (certifikovaný ISO/IEC 27001, kompatibilní s 21 CFR Part 11), který odhalí pouze další přiřazení v době randomizace.

Systém elektronického sběru dat (EDC) řídí randomizaci na základě ověření způsobilosti v reálném čase: objem semene ≥1 ml, koncentrace ≥1 milion/ml, progresivní motilita ≥10 % a podepsaný informovaný souhlas v záznamu. Pokud není splněno žádné kritérium, randomizace není uvolněna a cyklus je zaznamenán jako selhání screeningu.

Strategie zaslepení Embryologové provádějící přípravu spermií nemohou být zaslepeni kvůli viditelným rozdílům mezi zařízeními a metodami. Klíčová hodnocení výsledků jsou však chráněna před zkreslením: všechny analýzy PGT-A provádí jediná referenční laboratoř (NOVA Genomics, Provo, UT) zaslepená k přiřazení léčebného ramene. Klasifikace embryí je prováděna embryology na místě podle jejich stanovených standardních operačních postupů bez centrálního hodnocení, čímž se zachovává reálná externí validita. Zaslepená laboratoř PGT-A hlásí euploidii, aneuploidii a mozaikový status pomocí standardizovaných kritérií.

Výběr míst a distribuce metod Místa musí provádět ≥200 cyklů IVF s PGT-A ročně a udržovat převažující metodu přípravy spermií v ≥90 % případů. Cílová distribuce metod: 70 % míst používajících DGC/swim-up jako standard péče (primární analytická kohorta) a až 30 % používajících mikrofluidní zařízení jako standard péče (exploratorní kohorta). Zajištění váhy pacientů zaručuje, že ≥75 % pacientů v kontrolním rameni je připraveno pomocí DGC/swim-up, aby se zachovala statistická síla pro primární srovnání. Čtvrtletní monitorovací přehledy posuzují distribuci metod; pokud zápis se standardem mikrofluidní péče překročí 25 % kontrolních pacientů, zaslepené hodnocení síly (pomocí pozorovaných základních sazeb bez odtajnění léčebného účinku) určí, zda jsou potřeba omezení zápisu.

Laboratorní standardizace

Pro minimalizaci variability mezi místy musí každé účastnící se místo:

• Používat stejnou formulaci kultivačního média u všech zapsaných pacientů bez ohledu na randomizační rameno
• Používat stejnou metodu počítání spermií (manuální vs CASA) a typ komůrky u všech zapsaných pacientů
• Používat stejnou metodu počítání a načasování pro hodnocení progresivní motility před i po přípravě
• Udržovat tyto metody beze změny po celou dobu studie Zpracování teploty se liší podle designu, aby odráželo reálnou praxi: rameno Harvester dodržuje pokyny k použití zařízení (inkubace při 37 °C), zatímco rameno standardní péče dodržuje ověřený standardní operační postup každého místa. Tyto rozdíly nejsou považovány za odchylky od protokolu.

Sběr a správa dat Zjednodušený sběr dat Pro minimalizaci zátěže míst při zachycení kvalitních dat protokol používá minimální formulář případové zprávy (CRF) vyžadující <2 minuty na cyklus pro základní pole: ID pacienta, identifikátor místa, léčebné rameno, počet 2PN, počet použitelných blastocyst, progresivní motilita před přípravou a progresivní motilita po přípravě. Volitelná metadata (den vývoje blastocysty, Gardnerovo hodnocení, fragmentace DNA, morfologie) jsou sbírána, pokud jsou k dispozici, ale neoddalují zápis.

Integrace technologií Tam, kde je k dispozici, se software Embryo Assist od Alife Health bezproblémově integruje s existujícím mikroskopickým hardwarem, což embryologům umožňuje zachycovat snímky embryí a zadávat data na centralizovaném místě bez narušení pracovního postupu. Místa bez instalace Embryo Assist mohou pokračovat pouze s minimálním CRF; zachycení snímků je volitelné a nebude oddalovat zápis. Tato strategie implementace bez zastavení zajišťuje, že přijetí technologie nebrzdí časové plány náboru.

Sledování zařízení a zajištění kvality Všechny kazety SwimCount Harvester jsou sledovány prostřednictvím dokumentace čísla šarže v CRF, aby byla zajištěna trasovatelnost a podpora zajištění kvality. Zařízení jsou poskytována věcně sponzorem (MotilityCount ApS) bez finanční kompenzace místům nebo vyšetřovatelům. Nedostatky zařízení (např. ucpání membrány, které se podle údajů výrobce vyskytuje v <1 % použití) jsou dokumentovány jako nežádoucí události a hlášeny sponzorovi a FDA podle požadavků.

Definice koncových bodů Primární koncový bod – míra využití blastocyst – je vypočítána jako počet použitelných blastocyst dělený počtem normálně oplozených oocytů (2PN) na úrovni pacienta. Protože všechny cykly v této studii podstupují PGT-A, „použitelné blastocysty“ jsou operacionalizovány jako blastocysty bioptované pro genetické testování podle standardních operačních postupů kliniky. Tato definice zajišťuje konzistenci napříč místy a zároveň odráží klinické rozhodnutí bioptovat embryo považované za vhodné pro potenciální použití.

Klíčový sekundární koncový bod – pravděpodobnost alespoň jednoho euploidního embrya na odběr – je binární výsledek (ano/ne) založený na výsledcích PGT-A ze zaslepené centrální laboratoře. Toto pacientům orientované měřítko přímo posuzuje, zda intervence zvyšuje pravděpodobnost mít přenosné euploidní embryo.

Progresivní motilita je deskriptivně shrnuta (před a po přípravě, s rozdílovými skóre) jako podpůrné laboratorní měřítko bez testování hypotéz. Další exploratorní koncové body zahrnují počty a podíly euploidních vs aneuploidních embryí, riziko nulových použitelných blastocyst na cyklus a volitelná hodnocení fragmentace DNA a morfologie.

Přístup statistické analýzy Primární estimand a rozhodovací pravidlo Primárním estimandem je rozdíl rizika v míře využití blastocyst (Harvester minus standardní péče) na úrovni pacienta v indexovém cyklu, analyzovaný v populaci s úmyslem léčit (všichni randomizovaní pacienti). Analýza používá stratifikovaný Mantel-Haenszelův rozdíl rizika podle místa s oboustranným 95% intervalem spolehlivosti. Nehorší je uzavřeno, pokud dolní mez intervalu spolehlivosti překročí -2,0 procentní body. Pokud je nehorší splněno, superiorita může být hlášena, když dolní mez intervalu spolehlivosti překročí nulu; toto tvrzení o superioritě je podpůrné a nemění primární závěr.

Zdůvodnění meze nehorší

Mez nehorší -2,0 procentní body pro využití blastocyst byla vybrána na základě:

1. Klinické relevance: mez odpovídá přibližně 10–15 % typické přirozené variability mezi místy pozorované v auditech míst (pozorované rozmezí: 12–18 procentních bodů napříč kvalitními centry IVF)
2. Zachování výkonu standardní péče: mez zachovává ≥90 % výkonu kontrolního ramene
3. Regulačního vedení: mez je v souladu se zásadami ICH E10 pro design studií nehorší
4. Dopadu na pacienty: mapování meze na pacientům orientované výsledky (např. pravděpodobnost ≥1 euploidního embrya) ukazuje očekávaný absolutní dopad ≤3 procentní body, což je klinicky zanedbatelné Velikost vzorku a síla S 800 pacienty na rameno napříč ≥15 místy má studie ≥80% sílu prokázat nehorší na mezi -2,0 procentní body, když je skutečný rozdíl mezi 0 a +5 procentními body a míra využití blastocyst standardní péče je přibližně 50 %. Pokud je skutečný rozdíl +7 procentních bodů (50 % na 57 %), má studie přibližně 80% sílu prokázat superioritu při oboustranném alfa=0,05.

Pro klíčový sekundární koncový bod (≥1 euploidní embryo na odběr), za předpokladu základní míry 45 % v rameni standardní péče, poskytuje 800 pacientů na rameno přibližně 80% sílu prokázat nehorší na mezi -2,5 procentní body, když je skutečný rozdíl mezi 0 a +5 procentními body.

Stratifikovaná Mantel-Haenszelova analýza zohledňuje shlukování na úrovni míst stratifikací podle místa. Výpočty síly předpokládají nízký intraklasický korelační koeficient (ICC=0,03) na základě pozorované homogenity mezi místy v současných protokolech PGT-A freeze-all napříč účastnícími se centry. Základní míry (50 % využití blastocyst, 45 % pravděpodobnost ≥1 euploidního embrya) byly ověřeny proti předstudijním auditům míst a současným multicentrickým observačním datům.

Zpracování chybějících dat a nulového oplodnění Pro primární koncový bod, pokud chybí jak čitatel (použitelné blastocysty), tak jmenovatel (2PN), je využití blastocyst konzervativně nastaveno na 0 %. Citlivostní analýzy zahrnují: (i) analýzu kompletních případů a (ii) vyloučení cyklů s chybějícími daty využití blastocyst.

Pro cykly s nulovým oplodněním (2PN=0) je využití blastocyst nastaveno na 0 % v primární analýze s úmyslem léčit, což odráží selhání léčby. Citlivostní analýza vylučuje cykly s nulovým oplodněním, aby posoudila robustnost.

Pro klíčový sekundární koncový bod, pokud chybí status euploidie, je pacient konzervativně považován za nemajícího euploidní embryo; bude hlášena citlivostní analýza kompletních případů.

Pokud chybí progresivní motilita před nebo po přípravě, rozdílové skóre chybí a tento pacient je vyloučen ze shrnutí progresivní motility (pouze kompletní případy).

Standardy kvality cílí na ≤5 % chybějících dat na úrovni pacienta pro primární koncové body a ≤10 % pro sekundární koncové body.

Kontrola multiplicity Existuje jeden primární koncový bod (míra využití blastocyst) s jediným testem nehorší; není vyžadována úprava multiplicity. Klíčový sekundární koncový bod (≥1 euploidní embryo) je analyzován inferenčně, ale neovlivňuje primární závěr; výsledky jsou interpretovány jako podpůrný důkaz. Všechny ostatní sekundární a exploratorní koncové body jsou analyzovány bez úpravy pro vícenásobná srovnání, přičemž výsledky jsou interpretovány jako exploratorní a hypotézu generující.

Podskupinové analýzy

Předem specifikované podskupinové analýzy zahrnují:

1. Pokročilý mateřský věk (≥40 let): očekávané n=320 pacientů (20 % kohorty)
2. Těžká oligospermie (<5 milionů/ml): analyzováno exploratorně na základě důkazů, že tato populace má významně kompromitované výsledky ICSI navzdory obcházení bariér přirozeného výběru, což naznačuje, že pokročilá selekce spermií může poskytnout neúměrný prospěch
3. Standardní přípravná metoda: DGC vs swim-up v rámci konvenčních míst standardní péče (primární analýza); místa s mikrofluidním standardem péče analyzována odděleně (exploratorně) Účinky podskupin budou hlášeny s 95% intervaly spolehlivosti, když N≥100 na rameno v rámci podskupiny; jinak budou výsledky pouze deskriptivní. Nebudou vypočítány p-hodnoty interakce, aby se předešlo falešně pozitivním zjištěním v poddimenzovaných srovnáních.

Interim monitoring Nebude provedena žádná formální interim analýza účinnosti nebo marnosti. Jediný průběžný přehled přibližně při 50 % plánovaných informací (definováno jako bod, kdy jsou data 2PN a využití blastocyst dostupná pro 50 % cílových cyklů) posoudí pouze bezpečnost, kvalitu dat a operační pokrok, bez odtajnění léčebného účinku.

Analýza složitosti protokolu a efektivity pracovního postupu

Mimo klinické koncové body studie zahrnuje unikátní analýzu složitosti protokolu, aby informovala o rozhodnutích reálné implementace. Nezávislý studijní tým přezkoumá všechny předložené protokoly standardní péče míst a Pokyny k použití SwimCount Harvester, aby posoudil:

• Počet požadovaných procedurálních kroků
• Požadavky na vybavení a spotřební materiál
• Požadavky na technické dovednosti a zátěž školení
• Potenciál standardizace protokolu napříč místy Souhrny specifické pro metody pro DGC, swim-up a mikrofluidní metody podpoří rozhodnutí o přijetí v laboratoři. Nebudou sbírána žádná data o časování na úrovni míst; analýza je založena výhradně na protokolových dokumentech předložených při zahájení studie. Tento přístup přímo řeší hlavní obavy ředitelů laboratoří týkající se proveditelnosti implementace bez přidání zátěže míst.

Monitorování bezpečnosti SwimCount Harvester je zdravotnický prostředek schválený FDA 510(k) a označený CE se zavedeným bezpečnostním profilem. Studie nezahrnuje žádné invazivní procedury nad rámec rutinní přípravy spermií pro IVF, což omezuje fyzická rizika na ta inherentní standardním metodám DGC nebo swim-up (např. menší expozice médiím pro centrifugaci). Mikrofluidní zařízení Harvester nezavádí žádná další fyzická rizika.

Nežádoucí události a nedostatky zařízení budou dokumentovány a hlášeny podle standardních postupů klinických studií IRB a sponzorovi. Závažné nežádoucí události (SAE) – definované jako jakákoli událost vyžadující lékařský zásah nad rámec rutinní péče IVF – budou hlášeny do 24 hodin IRB a sponzorovi, s nezávažnými AE hlášenými v rutinních monitorovacích intervalech. Nežádoucí události související se zařízením zahrnují jakoukoli poruchu zařízení vyžadující použití záložní přípravné metody.

Vzhledem ke schválenému statusu zařízení a zavedenému bezpečnostnímu profilu není vyžadován nezávislý Výbor pro data a bezpečnost. Nezávislý monitor přezkoumá bezpečnostní data v průběžném operačním kontrolním bodě, aby určil, zda nepředvídané problémy vyžadují úpravu nebo zastavení studie, ačkoli se žádné neočekávají vzhledem k nízkorizikovému zařazení zařízení.

Regulační a etické aspekty Informovaný souhlas Informovaný souhlas je získán od obou partnerů alespoň 24 hodin před odběrem oocytů, aby byl dostatek času na zvážení a otázky. Randomizace probíhá v den odběru po potvrzení pokračující účasti a ověření kritérií způsobilosti. Účastníci se mohou kdykoli stáhnout bez ovlivnění jejich klinické péče.

Střety zájmů Tuto studii sponzoruje MotilityCount ApS, výrobce zařízení SwimCount Harvester. Sponzor poskytuje věcnou podporu prostřednictvím darování studijních zařízení (kazety 1 ml a 3 ml) a školení pro účastnící se místa, v hodnotě přibližně 50 000 USD na základě projekcí míst. Hlavním vyšetřovatelům, personálu míst ani účastníkům nejsou poskytovány žádné finanční kompenzace, pobídky, platby nebo podílové zájmy.

Správu dat a randomizaci poskytuje Sealed Envelope Ltd., smluvní poskytovatel služeb bez finančního zájmu na výsledcích studie. Statistickou analýzu provádí nezávisle studijní statistik bez finančního vztahu s MotilityCount ApS. Centrální laboratoř PGT-A (NOVA Genomics) nemá žádné znalosti o přiřazení léčebných ramen a žádný finanční zájem na výsledcích studie.

Přezkum IRB a dodržování GCP Studie bude přezkoumána Centrálním IRB (WCG Clinical) s účastnícími se místy fungujícími pod dohodami o spolehnutí tam, kde to umožňuje institucionální politika. Hlavní hlavní vyšetřovatel drží aktuální certifikace CITI GCP (FDA Devices) a CITI Biomedical/Behavioral Investigator and Social & Behavioral Research a je výhradně odpovědný za zajištění dodržování GCP napříč všemi místy. Personál míst obdrží studijně specifické školení GCP prostřednictvím 30–60minutové virtuální relace vedené hlavním PI nebo zástupcem, pokrývající dodržování protokolu, informovaný souhlas, hlášení nežádoucích událostí, integritu dat a delegování. Pro personál míst není vyžadována nezávislá certifikace CITI; dokumentace ze schůzky a potvrzovací formuláře podepsané po relaci potvrzují porozumění.

Ochrana soukromí a dat Data jsou anonymizována a spravována v souladu s HIPAA (místa v USA) a GDPR (místa v EU). Systém EDC (Sealed Envelope Red Pill) je kompatibilní s 21 CFR Part 11 a validován GCP. Přeshraniční přenosy dat budou používat standardní smluvní doložky nebo ekvivalentní záruky tam, kde je to použitelné.

S souhlasem účastníků mohou být anonymizovaná data uchovávána v výzkumném úložišti spravovaném sponzorem až 15 let a použita pro budoucí studie schválené IRB/EC související s asistovanou reprodukcí, laboratorním pracovním postupem a metodami hodnocení embryí. Externí přístup (akademický nebo komerční) bude vyžadovat Dohodu o použití dat a schválení Studijním výborem pro přístup k datům. Účastníci mohou stáhnout souhlas pro budoucí použití kdykoli před anonymizací.

Sekundární a exploratorní analýzy

Datová sada studie může být zpřístupněna pro předem specifikované sekundární analýzy po dokončení primární studie a publikaci primárních výsledků. Očekávané sekundární analýzy zahrnují:

1. Validace AI algoritmu: Analýza dat morfologie embryí zachycených prostřednictvím Embryo Assist k validaci predikčních modelů založených na AI pro euploidii embryí, ve spolupráci s Alife Health. Tato analýza bude korelovat hodnocení morfologie, parametry time-lapse a výsledky euploidie, aby zlepšila prediktivní algoritmy pro vývojový potenciál embryí a genetickou kompetenci.
2. Podskupinové a metoda-specifické analýzy: Další analýzy efektivity pracovního postupu podle podskupin pacientů, korelační analýzy mezi parametry spermií a následnými výsledky embryí a analýzy účinnosti specifické pro přípravné metody.
3. Příspěvek k metaanalýze: Anonymizovaná individuální data pacientů mohou být přispěna do systematických přehledů a metaanalýz zkoumajících techniky přípravy spermií v ART, aby se zlepšila syntéza důkazů.

Všechny sekundární analýzy budou používat plně anonymizované datové sady s odstraněnými identifikátory pacientů podle standardů HIPAA Safe Harbor. Sekundární analýzy vyžadují před zahájením samostatné schválení IRB nebo určení výjimky. Vývoj AI algoritmů bude v souladu s institucionálními politikami správy AI a pokyny FDA týkající se AI/ML ve zdravotnických prostředcích.

Časový plán studie

• Měsíce 0–1: Kvalifikace, výběr a smluvní uzavření míst; nastavení systému EDC/randomizace Sealed Envelope; příprava softwaru Embryo Assist
• Měsíc 2: Školení míst, schválení IRB, instalace a validace Embryo Assist
• Měsíce 3–16: Zápis pacientů (cíl: 115 pacientů/měsíc napříč všemi místy)
• Měsíc 17: Uzavření databáze a předběžná analýza
• Měsíc 18: Kompletní statistická analýza a kontroly kvality
• Měsíc 19: Závěrečná statistická zpráva
• Měsíc 20: Příprava rukopisu a konferenčních abstraktů Celková doba zápisu: 14 měsíců (měsíce 3–16). Očekávaný dopad Tato studie řeší kritickou mezeru v důkazech v reprodukční medicíně tím, že poskytuje první adekvátně silnou, multicentrickou randomizovanou kontrolovanou studii, která určí, zda pokročilá mikrofluidní příprava spermií přechází do smysluplných zlepšení klinických výsledků IVF. Existující studie jsou omezeny malými velikostmi vzorků, jednocentrovými designy a nekonzistentními komparátory, s nápadným nedostatkem analýz specifických pro metody nebo síly pro exploraci podskupin.

Očekávaný zisk 7,0 procentních bodů ve využití blastocyst by mohl snížit počet cyklů IVF potřebných na živě narozené dítě, což posouvá péči pro miliony párů postižených mužským faktorem neplodnosti. Zlepšení progresivní motility (očekávané +7,5 procentních bodů) bude hodnoceno jako podpůrné laboratorní měřítko zlepšení kvality spermií.

Kombinací důkladného hodnocení klinických koncových bodů s praktickou analýzou pracovního postupu tato studie poskytne laboratořím ART kvalitní důkazy pro výběr metody přípravy spermií, podporující přístupy precizní medicíny v reprodukční péči.