Mejora de la acción anabólica de los alimentos de origen vegetal mediante proteínas complementarias (CompProtein)

1. Preparación de la prueba preliminar: los participantes llegarán a la sesión de prueba preliminar después de un ayuno nocturno (~ 10 h sin consumir alimentos/bebidas calóricas) y habiéndose abstenido de hacer ejercicio durante las 72 h anteriores. Antes de cualquier procedimiento en persona, se informará a los participantes sobre los procedimientos y riesgos asociados con la participación mediante la revisión del documento de consentimiento informado. Se alentará a los participantes a hacer preguntas y obtener respuestas antes de que se les pregunte si desean continuar. La confirmación se documentará mediante la firma en un formulario de proceso de consentimiento informado.

   1.1 Antropometría: previa prestación de consentimiento, se medirán la altura y el peso de los participantes para confirmar que el índice de masa corporal (IMC) está dentro de los límites de elegibilidad (18,5 - 30 kg/m^2). Dado que los participantes ya han sido evaluados según todos los demás criterios de inclusión y exclusión, un IMC elegible resultará en la inclusión del estudio y la continuación de la sesión de prueba preliminar. Tras la confirmación de la elegibilidad para el estudio, un miembro capacitado del equipo de investigación medirá la presión arterial. Posteriormente, la composición corporal se determinará mediante absorciometría de rayos X de energía dual (DEXA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se pedirá a los participantes que se quiten todos los objetos metálicos de su persona antes de que un técnico capacitado los coloque en posición para medir con precisión la masa corporal magra y la masa grasa. La exploración dura aproximadamente de 6 a 10 minutos durante los cuales se le indicará al participante que permanezca inmóvil.

   1.2 Tasa metabólica en reposo: la tasa metabólica en reposo (RMR) se evaluará mediante calorimetría indirecta. Esta es una prueba sin esfuerzo mediante la cual la RMR se mide utilizando un sistema automatizado de análisis de gases. Este dispositivo mide el consumo de oxígeno y la producción de dióxido de carbono como la diferencia entre las concentraciones de gas inspirado y espirado. Antes del comienzo de la prueba, los participantes se acostarán en decúbito supino sobre una mesa y se colocará una capucha de plástico duro transparente y una cortina de plástico transparente suave sobre el cuello, la cabeza y los hombros de los participantes para capturar los gases espirados. Luego, los participantes permanecerán inmóviles sin quedarse dormidos mientras se capturan las concentraciones de gas respiratorio. Las pruebas concluirán cuando la RMR sea estable durante al menos 20 minutos (normalmente ~30 minutos desde el inicio).

   1.3 Prueba de diez repeticiones máximas (10RM): después de la prueba de la tasa metabólica en reposo, a los participantes se les evaluará su 10RM para la extensión y prensa de piernas. Para comenzar, los participantes pedalearán a un ritmo autoseleccionado en un cicloergómetro estándar durante aproximadamente 5 minutos. Luego, los participantes completarán una serie de 8 a 10 repeticiones a ~50% de su 10RM previsto, seguidas de 1 a 2 minutos de descanso. Luego, la carga se establecerá en ~90% de sus 10RM previstos. La carga aumentará entre un 2,5 y un 5,0 %. siguiendo cada intento exitoso hasta el fracaso (normalmente dentro de 5 intentos). Se asignarán dos minutos de descanso entre intentos máximos y 5 minutos entre ejercicios. Primero se probará la extensión de piernas y luego la prensa de piernas. Antes de abandonar el laboratorio, los participantes podrán plantear cualquier duda que tengan antes de concluir la sesión.

   1.4 Registro de dieta habitual: la ingesta dietética actual se evaluará a través de un sistema de registro de dieta autoadministrado automatizado en línea (ASA24). Los participantes recibirán su nombre de usuario y contraseña individual y privada. Se les pedirá que registren 3 días consecutivos (2 días laborables, 1 día de fin de semana). Al ser un sistema online, pueden completar fuera del sitio, cuando quieran.

   1.5 Planificación: antes de abandonar el laboratorio, los participantes y el equipo de investigación identificarán una fecha para la primera prueba de infusión (al menos 7 días después de la prueba preliminar). Además, el equipo de investigación proporcionará a los participantes una comida estandarizada para consumir la noche anterior a la primera infusión e instrucciones para abstenerse de realizar ejercicio extenuante y consumir alcohol durante las 72 y 24 horas previas a la primera prueba. También se ofrecerá a los participantes un refrigerio antes de abandonar el laboratorio.

2. Ensayos de infusión

2.1 Preparación: al menos 7 días después de la prueba preliminar o de la infusión anterior, se pedirá a los participantes que regresen al laboratorio para una prueba de infusión. En la mañana de cada infusión, los participantes llegarán al laboratorio por la mañana después de un ayuno nocturno (~ 10 h sin consumo de alimentos/bebidas calóricas) y de haberse abstenido de ejercicio extenuante y consumo de alcohol durante 72 y 24 horas, respectivamente. Durante los 3 días anteriores a cada prueba, se pedirá a los participantes que registren su ingesta dietética a través de un sistema de registro dietético autoadministrado (24 horas) automatizado en línea (ASA24).

2.2 Infusión de isótopos estables: al llegar al laboratorio, los participantes se acostarán en decúbito supino en una cama estilo clínica antes de que se les coloque un catéter intravenoso en una vena dorsal de la mano o del brazo. No se harán más de cuatro intentos para colocar el catéter. Después del muestreo de sangre inicial, se administrará una dosis inicial de L-[ring-13C6]fenilalanina (2 μmol/kg) antes del inicio de una infusión constante (0,05 μmol/kg/min) utilizando una bomba de infusión calibrada. Los trazadores de aminoácidos de isótopos estables aplicados en este experimento no son radiactivos y son completamente seguros. Estos isótopos estables enriquecerán la reserva de aminoácidos del cuerpo, permitiéndonos identificar la tasa de incorporación de aminoácidos en los tejidos. La preparación de los trazadores para la administración intravenosa se realizará en un ambiente estéril bajo una campana de flujo laminar dedicada a la preparación de los trazadores y de acuerdo con las pautas de Buenas Prácticas de Fabricación.

2.3 Extracción de sangre: Después del inicio de la infusión, se colocará un segundo catéter intravenoso en el lado contralateral en una vena de la mano o del brazo para repetir la toma de muestras de sangre. Se recolectarán muestras de sangre 12 veces durante la primera infusión y 10 veces durante la segunda infusión. En los momentos que coinciden con los tiempos de la biopsia (-150, -30 y 300 min), se recolectarán ~16 ml (7 ml de plasma, 7 ml de suero y ~2 ml de desechos). En todos los demás puntos de tiempo (-210, -90, 0, 30, 60, 90, 120, 180 y 240 min) se recolectarán ~9 ml (7 ml de plasma y ~2 ml de residuos). Por lo tanto, el volumen total recolectado durante la primera y la segunda infusión será de ~129 ml y ~104 ml, respectivamente. La sangre se recolectará en tubos de vacío mediante un dispositivo de acceso Leur-Lok conectado a una llave de paso de 4 vías. Entre extracciones, el catéter se mantendrá permeable mediante un goteo de solución salina a baja velocidad (~60 cc/h).

2.4 Recolección de músculos: se recolectarán un total de cinco biopsias de músculos (tres como parte de la 1.ª infusión y dos durante la 2.ª infusión). El procedimiento de biopsia implica la extracción de una pequeña porción de tejido muscular utilizando una aguja hueca estéril (aguja Bergström) y será realizado por el Dr. Nicholas Burd bajo los auspicios del Dr. Jared Willard, MD. Los participantes descansarán en una cama y se afeitará el área de la biopsia, si es necesario. Posteriormente, se esterilizará la zona utilizando gluconato de clorhexidina al 4% antes de inyectar por vía subcutánea 5 ml de anestésico local (xilocaína al 2% con epinefrina 1:100.000) con especial cuidado para evitar infiltrar el músculo. Una vez que el anestésico esté activo (~10 min), el Dr. Burd hará una pequeña incisión (~4-5 mm) en la piel para crear una abertura a través de la cual pasar la aguja de biopsia para la recolección de tejido. El Dr. Burd cortará rápidamente un pequeño trozo de músculo (~50-100 mg; aproximadamente del tamaño de una goma de borrar de lápiz estándar) y retirará la aguja de la pierna del sujeto. Durante la recolección de la muestra (~30 segundos), los sujetos pueden sentir una sensación de presión profunda en la pierna. Se colocará un paño desechable esterilizado debajo del muslo del participante y se utilizarán guantes esterilizados para todos los procedimientos de biopsia.

Una vez completada la biopsia, un miembro capacitado del equipo de investigación aplicará presión con una gasa esterilizada hasta que se detenga el sangrado (al menos 10 minutos). Posteriormente, se cerrará el sitio de la incisión mediante puntos de mariposa (Steri-strips) y luego se aplicará un vendaje. Se aplicará una venda elástica de presión encima del vendaje para minimizar la posibilidad de hematomas. Luego, se indicará a los participantes que dejen los puntos de mariposa y la venda de presión en la herida durante 96 y 24 horas, respectivamente.

El participante recibirá un "kit de cuidado de biopsia" (descrito en la sección 10.1/Kit de cuidado de biopsia) para poder cuidar adecuadamente la incisión después de salir del laboratorio. Un miembro del equipo de investigación se comunicará con los participantes al día siguiente del ensayo para comprobar el proceso de curación.

2.5 Ejercicio de resistencia e ingestión de comidas: Inmediatamente después del cierre de la segunda biopsia en la primera prueba de infusión y después del cierre de la primera biopsia en la segunda prueba, los participantes comenzarán a calentar para una sesión aguda de ejercicio de resistencia. Para comenzar, los participantes pedalearán a un ritmo autoseleccionado en un cicloergómetro estándar durante 5 minutos. Posteriormente, los participantes comenzarán el ejercicio de resistencia. Los participantes completarán una serie de calentamiento a ~60% de su máximo de diez repeticiones (10RM) medido en la prueba preliminar, seguido de 4 series de 10-12 repeticiones a ~90% 10RM con 1-3 minutos de descanso entre series para extensión de piernas y prensa de piernas. Los participantes igualarán la carga, las series y las repeticiones de la primera infusión durante su segunda prueba.

Inmediatamente después de finalizar el ejercicio, los participantes regresarán a la sala de infusión para consumir su comida. Durante su primera infusión, los participantes serán asignados al azar para consumir 246 g de arroz y frijoles negros disponibles comercialmente (~610 kcal; ~20 g de proteína, ~127 g de carbohidratos) o una bebida isocalórica e isonitrogenada de aminoácidos cristalizados y maltodextrina. Durante su segunda prueba, los participantes serán asignados aleatoriamente para consumir la condición restante.

El arroz y los frijoles negros disponibles comercialmente se cocinarán y mezclarán por separado justo antes de su consumo el día de la prueba de infusión. La comida se cocinará a una temperatura interna de al menos 160 °F de acuerdo con la temperatura interna mínima del USDA para prevenir enfermedades transmitidas por los alimentos.