Migliorare l'azione anabolica degli alimenti a base vegetale utilizzando proteine ​​complementari (CompProtein)

1. Preparazione al test preliminare: i partecipanti arriveranno per la sessione di test preliminare dopo un digiuno notturno (~ 10 ore senza cibi/bevande calorici consumati) e dopo essersi astenuti dall'esercizio fisico per le 72 ore precedenti. Prima di qualsiasi procedura di persona, i partecipanti verranno informati sulle procedure e sui rischi associati alla partecipazione tramite la revisione del documento di consenso informato. I partecipanti saranno incoraggiati a porre domande e a ricevere risposte alle loro domande prima che venga loro chiesto se desiderano continuare. La conferma sarà documentata mediante firma su un modulo di consenso informato.

   1.1 Antropometria: previo consenso, l'altezza e il peso dei partecipanti verranno misurati per confermare che l'indice di massa corporea (BMI) rientra nei limiti di ammissibilità (18,5 - 30 kg/m^2). Poiché i partecipanti sono già stati valutati per tutti gli altri criteri di inclusione ed esclusione, un BMI idoneo comporterà l'inclusione nello studio e la continuazione della sessione di test preliminare. Dopo la conferma dell'idoneità allo studio, la pressione sanguigna verrà misurata da un membro addestrato del gruppo di ricerca. Successivamente, la composizione corporea sarà determinata tramite assorbimetria a raggi X a doppia energia (DEXA) in conformità con le raccomandazioni del produttore. In breve, ai partecipanti verrà chiesto di rimuovere tutti gli oggetti metallici dalla propria persona prima di essere posizionati da un tecnico qualificato per la misurazione accurata della massa corporea magra e della massa grassa. La scansione dura circa 6-10 minuti durante i quali al partecipante verrà chiesto di rimanere immobile.

   1.2 Tasso metabolico a riposo: il tasso metabolico a riposo (RMR) sarà valutato tramite calorimetria indiretta. Si tratta di un test senza sforzo in cui l'RMR viene misurato utilizzando un sistema automatizzato di analisi del gas. Questo dispositivo misura il consumo di ossigeno e la produzione di anidride carbonica come differenza tra le concentrazioni di gas inspirato ed espirato. Prima dell'inizio del test, i partecipanti giaceranno supini su un tavolo e un cappuccio di plastica rigida trasparente e un telo di plastica morbida e trasparente verranno posizionati sul collo, sulla testa e sulle spalle dei partecipanti per catturare i gas espirati. I partecipanti rimarranno quindi immobili senza addormentarsi mentre vengono catturate le concentrazioni di gas respiratorio. Il test si concluderà quando l'RMR sarà stabile per almeno 20 minuti (in genere ~ 30 minuti dall'inizio).

   1.3 Test massimo di dieci ripetizioni (10RM): dopo il test del tasso metabolico a riposo, i partecipanti verranno testati con il loro 10RM per l'estensione della gamba e la pressa della gamba. Per iniziare, i partecipanti pedaleranno ad un ritmo autoselezionato su un cicloergometro standard per circa 5 minuti. I partecipanti completeranno quindi una serie di 8-10 ripetizioni a circa il 50% dei 10RM previsti seguiti da 1-2 minuti di riposo. Il carico verrà quindi impostato a circa il 90% dei 10RM previsti. Il carico verrà aumentato del 2,5-5,0% dopo ogni tentativo riuscito fino al fallimento (in genere entro 5 tentativi). Saranno concessi due minuti di riposo tra i tentativi massimali e 5 minuti tra gli esercizi. Verrà testata prima l'estensione della gamba, seguita dalla pressa della gamba. Prima di lasciare il laboratorio, i partecipanti potranno porre eventuali domande prima di concludere la sessione.

   1.4 Registro della dieta abituale: l'assunzione attuale della dieta sarà valutata attraverso un sistema di registrazione della dieta autosomministrato automatizzato online (ASA24). I partecipanti riceveranno il loro nome utente e password individuali e privati. Verrà chiesto loro di registrare 3 giorni consecutivi (2 giorni feriali, 1 giorno del fine settimana). Poiché si tratta di un sistema online, possono completarlo fuori sede, a loro piacimento.

   1.5 Pianificazione: prima di lasciare il laboratorio, i partecipanti e il gruppo di ricerca identificheranno una data per la prima prova di infusione (almeno 7 giorni dopo il test preliminare). Inoltre, il gruppo di ricerca fornirà ai partecipanti un pasto standardizzato da consumare la sera prima della prima infusione e istruzioni per astenersi da esercizi fisici faticosi e dal consumo di alcol per le 72 e 24 ore precedenti la prima prova. Ai partecipanti verrà inoltre offerto uno spuntino prima di lasciare il laboratorio.

2. Prove di infusione

2.1 Preparazione: almeno 7 giorni dopo i test preliminari o l'infusione precedente, ai partecipanti verrà chiesto di tornare in laboratorio per una prova di infusione. La mattina di ciascuna infusione, i partecipanti arriveranno al laboratorio la mattina dopo un digiuno notturno (~ 10 ore senza cibi/bevande caloriche consumate) e dopo essersi astenuti dall'esercizio fisico intenso e dal consumo di alcol per 72 e 24 ore, rispettivamente. Per 3 giorni prima di ogni prova, ai partecipanti verrà chiesto di registrare la propria assunzione dietetica tramite un sistema di registrazione dietetica autosomministrato online (24 ore) automatizzato (ASA24).

2.2 Infusione di isotopi stabili: all'arrivo in laboratorio, i partecipanti giaceranno supini su un letto in stile clinico prima di inserire un catetere endovenoso nella vena dorsale della mano o del braccio. Non verranno effettuati più di quattro tentativi per posizionare il catetere. Dopo il prelievo di sangue basale, verrà somministrata una dose iniziale di L-[anello-13C6]fenilalanina (2 μmol/kg) prima dell'inizio di un'infusione costante (0,05 μmol/kg/min) utilizzando una pompa di infusione calibrata. I traccianti di aminoacidi isotopici stabili applicati in questo esperimento non sono radioattivi e sono completamente sicuri. Questi isotopi stabili arricchiranno il pool di aminoacidi nel corpo permettendoci di identificare il tasso di incorporazione degli aminoacidi nei tessuti. La preparazione dei traccianti per la somministrazione endovenosa avverrà in un ambiente sterile sotto una cappa a flusso laminare dedicata alla preparazione dei traccianti e in conformità con le linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione.

2.3 Prelievo del sangue: dopo l'inizio dell'infusione, un secondo catetere endovenoso verrà posizionato sul lato controlaterale in una vena della mano o del braccio per ripetere il prelievo di sangue. I campioni di sangue verranno raccolti 12 volte durante la prima infusione e 10 volte durante la seconda infusione. Nei punti temporali che coincidono con i tempi della biopsia (-150, -30 e 300 minuti), verranno raccolti ~16 mL (7 mL di plasma, 7 mL di siero e ~2 mL di rifiuti). In tutti gli altri punti temporali (-210, -90, 0, 30, 60, 90, 120, 180 e 240 minuti) verranno raccolti ~9 mL (7 mL di plasma e ~2 mL di rifiuti). Pertanto, il volume totale raccolto durante la prima e la seconda infusione sarà rispettivamente di ~129 ml e ~104 ml. Il sangue verrà raccolto in provette sottovuoto utilizzando il dispositivo di accesso Leur-Lok collegato a un rubinetto a 4 vie. Tra un prelievo e l'altro, il catetere verrà mantenuto pervio utilizzando una flebo di soluzione salina a bassa velocità (~60 cc/ora).

2.4 Raccolta muscolare: verranno raccolte un totale di cinque biopsie muscolari (tre come parte della prima infusione e due durante la seconda infusione). La procedura di biopsia prevede la rimozione di un piccolo pezzo di tessuto muscolare utilizzando un ago cavo sterile (ago Bergström) e sarà eseguita dal Dr. Nicholas Burd sotto gli auspici del Dr. Jared Willard, MD. I partecipanti riposeranno su un letto e l'area per la biopsia verrà rasata, se necessario. Successivamente, l'area verrà sterilizzata utilizzando clorexidina gluconato al 4% prima di iniettare per via sottocutanea 5 ml di anestetico locale (xilocaina al 2% con adrenalina 1:100.000) con particolare attenzione per evitare infiltrazioni nel muscolo. Una volta che l'anestetico è attivo (~10 minuti), il Dr. Burd eseguirà una piccola incisione (~4-5 mm) nella pelle per creare un'apertura attraverso la quale inserire l'ago da biopsia per la raccolta dei tessuti. Il Dr. Burd taglierà rapidamente un piccolo pezzo di muscolo (~50-100 mg; circa le dimensioni di una gomma da matita standard) e rimuoverà l'ago dalla gamba del soggetto. Durante il prelievo del campione (~30 sec), i soggetti possono avvertire una sensazione di profonda pressione alla gamba. Un telo monouso sterile verrà posizionato sotto la coscia del partecipante e verranno utilizzati guanti sterili per tutte le procedure di biopsia.

Una volta completata la biopsia, un membro addestrato del gruppo di ricerca applicherà pressione con una garza sterile fino all'arresto dell'emorragia (almeno 10 minuti). Successivamente, il sito di incisione verrà chiuso utilizzando punti a farfalla (Steri-strip) seguiti dall'applicazione di una benda. Verrà applicata una fascia elastica di pressione sopra la benda per ridurre al minimo il rischio di lividi. Ai partecipanti verrà quindi chiesto di lasciare i punti a farfalla e la fascia a pressione sulla ferita rispettivamente per 96 e 24 ore.

Al partecipante verrà fornito un "kit per la cura della biopsia" (descritto nella sezione 10.1/Kit per la cura della biopsia) per curare adeguatamente l'incisione dopo aver lasciato il laboratorio. Un membro del gruppo di ricerca contatterà i partecipanti il ​​giorno successivo alla sperimentazione per verificare il processo di guarigione.

2.5 Esercizio di resistenza e ingestione di pasti: immediatamente dopo la chiusura della seconda biopsia nella prima prova di infusione e dopo la chiusura della prima biopsia nella seconda prova i partecipanti inizieranno il riscaldamento per un periodo acuto di esercizio di resistenza. Per iniziare, i partecipanti pedaleranno ad un ritmo autoselezionato su un cicloergometro standard per 5 minuti. Successivamente, i partecipanti inizieranno esercizi di resistenza. I partecipanti completeranno una serie di riscaldamento a circa il 60% del loro massimo di dieci ripetizioni (10RM) misurato durante i test preliminari seguito da 4 serie da 10-12 ripetizioni a circa il 90% di 10RM con 1-3 minuti di riposo tra le serie sia per l'estensione della gamba che per pressa per le gambe. I partecipanti abbineranno il carico, le serie e le ripetizioni della prima infusione durante la seconda prova.

Immediatamente dopo il completamento dell'esercizio, i partecipanti torneranno nella sala infusioni per consumare il pasto. Durante la prima infusione, i partecipanti verranno assegnati in modo casuale a consumare 246 g di riso e fagioli neri disponibili in commercio (~610 kcal; ~20 g di proteine, ~127 g di carboidrati) o una bevanda isocalorica e isoazotata di aminoacidi cristallizzati e maltodestrina. Durante la seconda prova, i partecipanti verranno assegnati in modo casuale a consumare la condizione rimanente.

Il riso e i fagioli neri disponibili in commercio verranno cotti e mescolati separatamente subito prima del consumo nel giorno della prova di infusione. Il pasto verrà cucinato a una temperatura interna di almeno 160°F in conformità con la temperatura interna minima stabilita dall'USDA per prevenire malattie di origine alimentare.