Saasteiden osallisuus atooppisessa ihottumassa ja psoriaasissa (DIAhR)

I. Johdanto Saastuminen on merkittävä osa altistumista, ja sillä on vakiintuneet yhteydet ihmisten terveyteen. Vuonna 2019 saastumisen arvioitiin aiheuttaneen 9 miljoonaa ennenaikaista kuolemaa, mikä tekee siitä neljänneksi suurimman kuolleisuuden riskitekijän maailmanlaajuisesti. Viimeisen 20 vuoden aikana saasteperäiset kuolemat ovat lisääntyneet 66 prosenttia. Tämä johtuu teollistumisesta, hallitsemattomasta kaupungistumisesta, väestönkasvusta, fossiilisten polttoaineiden polttamisesta ja rajoittavien politiikkojen puutteesta joillakin alueilla.

Ihokerros koostuu monimutkaisesta soluverkostosta, joka muodostaa mekaanisen ja biologisen esteen, joka on välttämätön kehon eheyden ja homeostaasin ylläpitämiselle. Saasteet voivat suoraan heikentää tätä toimintaa ylittämällä esteen tai pääsemällä systeemiseen verenkiertoon hengitettynä tai nieltynä.

Atooppinen ihottuma (AD) ja psoriaasi ovat kroonisia tulehduksellisia ihosairauksia, joiden alkuperä on monitekijäinen, mukaan lukien geneettinen taipumus, immuunijärjestelmän häiriöt ja ympäristötekijät. Epidemiologiset tutkimukset ovat osoittaneet positiivisen korrelaation ilmansaasteiden ja näiden sairauksien kehittymisen välillä.

Kun otetaan huomioon niiden korkea esiintyvyys ja oireiden vaikutus potilaiden elämänlaatuun, näiden sairauksien altistumisen parempi ymmärtäminen on suuri haaste.

Kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että aromaattisen hiilivetyreseptorin (AhR) reitillä on merkittävä rooli saasteiden vaikutuksessa psoriaasiin ja AD:hen. AhR on transkriptiotekijä, joka osallistuu vasteeseen ympäristön epäpuhtauksille, ja se pysyy inaktiivisena sytoplasmisessa kompleksissa chaperoniproteiinien kanssa. Sitoutuessaan ligandiinsa AhR siirtyy ytimeen ja dimeroituu ydinkumppaninsa Arntin kanssa. Kompleksin aktivoituminen johtaa useiden geenien ilmentymiseen, jotka sisältävät promoottorissaan konsensussekvenssin, joka tunnetaan nimellä ksenobioottinen vasteelementti (XRE).

AhR:n aktivaattoriligandit sisältävät ympäristössä esiintyviä ksenobiootteja, pääasiassa polysyklisiä aromaattisia hiilivetyjä (PAH), dioksiineja ja niin sanottuja "dioksiinin kaltaisia" yhdisteitä 12. Tätä signalointireittiä pidetään "adaptiivisena" vasteena kehon myrkkyjen poistamiseksi erilaisista eksogeenisistä yhdisteistä. Kuitenkin tällaisten aineiden aiheuttama AhR:n pitkittynyt aktivointi voi johtaa tulehdusprosessin deregulaatioon, mikä edistää psoriaasin ja AD:n kehittymistä.

Aryylihiilivetyreseptori (AhR) säätelee sytokromien 1A1 (CYP1A1) ja 1B1 (CYP1B1) transkriptiota. Sytokromit ovat monigeenisen entsyymiperheen jäseniä, jotka osallistuvat ksenobioottiseen aineenvaihduntaan. Nämä entsyymit katalysoivat HAP:ien bioaktivoitumista elektrofiilisiksi metaboliiteiksi, mikä johtaa NFKB:n, tulehdusvasteen avaintekijän, aktivoitumiseen. Katalyyttisen syklinsä aikana nämä CYP1-entsyymit tuottavat reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka synnyttävät oksidatiivista stressiä. Lisäksi AhR on vastuussa proinflammatoristen sytokiinien, mukaan lukien IL1β:n, TNFa:n, IL23:n, IL17:n ja IFNy:n, ilmentymisen säätelystä. Se voi vaikuttaa suoraan Th17-lymfosyyttien ja säätelevien T-solujen (Tregs) väliseen tasapainoon, mikä mahdollisesti edistää ihon tulehdusprosesseja.

Lisätutkimusta tarvitaan kuitenkin AhR:n roolin paremmin määrittelemiseksi kroonisten tulehduksellisten dermatoosien patogeneesissä. Tämä auttaa näiden sairauksien hallinnassa ja ehkäisyssä, varsinkin kun ympäristön riskitekijät liittyvät alttiuteen.

II. Tavoite:

Oletetaan, että AhR:n aktivaatiolla eksogeenisilla ligandeilla voi olla merkitystä atooppisen dermatiitin ja psoriaasin kehittymisessä.

Päätavoitteena on verrata AhR-reitin aktivaatiomarkkerien tasoja tapausten ja kontrollien välillä.

Toissijaisiin tavoitteisiin kuuluu ympäristöaltistuksen korreloiminen AhR-ligandeille potilaiden sairauden vaikeusasteen kanssa.

Lopuksi vertaamme tulehduksellisten ja AhR-aktivaatiomarkkerien ilmentymistä viljellyissä perifeerisen veren mononukleaarisissa soluissa (PBMC:t) in vitro -stimulaation jälkeen bentso(a)pyreenillä.

III. Materiaali ja metodit:

Teemme tapauskontrollitutkimuksen:

• Tapaus: Potilaat, joilla on psoriaasia tai atooppista ihottumaa vastaava krooninen tulehduksellinen dermatoosi.
• Kontrollit: Ihotautiosastoa konsultoivat ihmiset, joilla ei ole näitä patologioita.

Kaikki osallistujat, mukaan lukien potilaat ja kontrollit, joutuvat konsultaatioon/sairaalaan ja biologisiin testeihin osana tavanomaista lääketieteellistä hoitoaan. Protokollan osana suoritetut toimenpiteet eivät häiritse heidän hoitoaan.

Toksikologista analyysiä varten otetaan 10 ml verta. Tulehduksellisten ja AhR-aktivaatiomerkkien arvioimiseksi otetaan 20 ml verta.

A. Epäpuhtauksien mittaus Verinäyte sentrifugoidaan, seerumi kerätään ja säilytetään -20 C:ssa, kunnes veren dioksiinit on analysoitu. 2,3,7,8-tetraklooridibentso-p-dioksiini (TCDD) ja polyklooribiphényle 118 (PCB118) mitataan verestä käyttämällä kaasukromatografiaa yhdistettynä korkean erotuskyvyn massaspektrometriaan (GC-HR-MS).

PAH-yhdisteille altistumisen biologista seurantaa varten 1-hydroksipyreeni (1-OHP) mitataan virtsasta käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografia-massaspektrometriaa (LC-MS-MS).

B. Tulehduksellisten ja AhR-aktivaatiomarkkerien arviointi

• PBMC:t eristetään 20 ml:n verinäytteestä käyttämällä standardia Ficoll®-gradienttiprotokollaa. Eristetyt solut ja seerumit jaetaan eriin ja pakastetaan myöhempiä kokeita varten AhR-signalointireitillä.
• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) -testiä käytetään tulehdusta edistävien sytokiinien IL1β, TNFa, IL23, IL17 ja IFNy mittaamiseen.
• Malondialdehydin (MDA) pitoisuus määritetään ELISA-menetelmällä lipidiperoksidaatioiden biomarkkerina, joka ilmaisee reaktiivisten happilajien (ROS) aiheuttaman oksidatiivisen stressin tason.
• Fluorokromikonjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita (CD4, CD25, CD127, FOXP3, Il17) käytetään fluoresenssiaktivoidussa solulajittelijassa (FACS) erilaisten lymfosyyttipopulaatioiden lukumäärän ja suhteiden arvioimiseksi PBMC:issä. Tutkimus keskittyy Th17- ja Treg-tasoihin.
• FACS:n avulla arvioidaan CYP1A1:n ja CYP1B1:n, jotka ovat AhR-kohdegeenien prototyyppejä, ilmentymistä PBMC:issä spesifisen kohdistuksen jälkeen.
• AhR:n ja NfkB:n aktiivisten fraktioiden ilmentymistasot määritetään käyttämällä suoraa immunofluoresenssitekniikkaa.
• PBMC-soluja viljellään anti-CD3+/-BaP:n (50 nM) kanssa soluinkubaattorissa (37 °C, 5 % CO2+ kontrolloitu kosteus) 48-72 tuntia. Kiinnostavat parametrit, mukaan lukien oksidatiivinen stressi, tulehdusta edistävät sytokiinit ja AhR-reitin arviointi, arvioidaan uudelleen sen jälkeen, kun lymfosyytti on aktivoitu uudelleen anti-CD3:lla BaP:n läsnä ollessa tai poissa ollessa.