Coinvolgimento degli inquinanti nella dermatite atopica e nella psoriasi (DIAhR)

I. Introduzione L'inquinamento è una componente significativa dell'esposizione, con legami accertati con la salute umana. Nel 2019, si stima che l’inquinamento sia responsabile di 9 milioni di morti premature, diventando così il quarto principale fattore di rischio di mortalità a livello mondiale. Negli ultimi 20 anni, i decessi legati all’inquinamento sono aumentati del 66%. Ciò è dovuto all’industrializzazione, all’urbanizzazione incontrollata, alla crescita della popolazione, all’uso di combustibili fossili e alla mancanza di politiche restrittive in alcune regioni.

Lo strato cutaneo è composto da una complessa rete di cellule che formano una barriera meccanica e biologica essenziale per il mantenimento dell'integrità e dell'omeostasi dell'organismo. L'inquinamento può compromettere direttamente questa funzione attraversando la barriera o entrando nella circolazione sistemica attraverso l'inalazione o l'ingestione.

La dermatite atopica (AD) e la psoriasi sono condizioni infiammatorie croniche della pelle con origini multifattoriali, tra cui predisposizione genetica, disregolazione immunitaria e fattori ambientali. Studi epidemiologici hanno dimostrato una correlazione positiva tra l’inquinamento atmosferico e lo sviluppo di queste malattie.

Considerata la loro elevata prevalenza e l’impatto dei sintomi sulla qualità della vita dei pazienti, una migliore comprensione dell’espositore in queste malattie rappresenta una sfida importante.

Studi sperimentali hanno dimostrato che la via del recettore degli idrocarburi aromatici (AhR) svolge un ruolo significativo nell’impatto degli inquinanti sulla psoriasi e sull’AD. AhR è un fattore di trascrizione coinvolto nella risposta agli inquinanti ambientali, che rimane inattivo in un complesso citoplasmatico con proteine ​​chaperone. Dopo essersi legato al suo ligando, AhR si trasloca nel nucleo e dimerizza con il suo partner nucleare, Arnt. L'attivazione del complesso porta all'espressione di numerosi geni che contengono nei loro promotori una sequenza consenso nota come elemento di risposta xenobiotica (XRE).

I ligandi attivatori dell'AhR comprendono xenobiotici presenti nell'ambiente, principalmente idrocarburi policiclici aromatici (IPA), diossine e i cosiddetti composti "simili alla diossina" 12. Questa via di segnalazione è considerata una risposta "adattativa" per disintossicare il corpo da vari composti esogeni. Tuttavia, l’attivazione prolungata dell’AhR da parte di tali agenti può portare alla deregolamentazione del processo infiammatorio, contribuendo allo sviluppo della psoriasi e dell’AD.

Il recettore degli idrocarburi arilici (AhR) regola la trascrizione dei citocromi 1A1 (CYP1A1) e 1B1 (CYP1B1), che sono membri di una famiglia multigenica di enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici. Questi enzimi catalizzano la bioattivazione degli HAP in metaboliti elettrofili che portano all'attivazione di NFκB, un attore chiave nella risposta infiammatoria. Durante il loro ciclo catalitico, questi enzimi CYP1 producono specie reattive dell'ossigeno (ROS), che generano stress ossidativo. Inoltre, l’AhR è responsabile della regolazione dell’espressione delle citochine proinfiammatorie, tra cui IL1β, TNFα, IL23, IL17 e IFNγ. Può influenzare direttamente l’equilibrio tra linfociti Th17 e cellule T regolatorie (Tregs), contribuendo potenzialmente ai processi infiammatori cutanei.

Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per definire meglio il ruolo dell’AhR nella patogenesi delle dermatosi infiammatorie croniche. Ciò aiuterà nella gestione e nella prevenzione di queste malattie, soprattutto quando i fattori di rischio ambientale sono associati alla predisposizione.

II. Obbiettivo:

Si ipotizza che l'attivazione di AhR con ligandi esogeni possa svolgere un ruolo nello sviluppo della dermatite atopica e della psoriasi.

L'obiettivo principale è confrontare i livelli dei marcatori di attivazione della via AhR tra casi e controlli.

Gli obiettivi secondari includono la correlazione dell'esposizione ambientale ai ligandi AhR con la gravità della malattia nei pazienti.

Infine, confronteremo l'espressione dei marcatori infiammatori e di attivazione AhR nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in coltura dopo stimolazione in vitro con benzo(a)pirene.

III. Materiale e metodi:

Effettueremo uno studio caso-controllo:

• Caso: Pazienti con dermatosi infiammatoria cronica corrispondente alla psoriasi o alla dermatite atopica.
• Controlli: persone che consultano il dipartimento di dermatologia che non presentano queste patologie.

Tutti i partecipanti, compresi i pazienti e i controlli, saranno sottoposti a consultazione/ospedalizzazione e test biologici come parte delle loro consuete cure mediche. Le procedure eseguite come parte del protocollo non interferiranno con la loro cura.

Verrà prelevato un campione di 10 ml di sangue per l'analisi tossicologica. Verranno prelevati 20 ml di sangue per la valutazione dei marcatori infiammatori e di attivazione AhR.

A. Misurazione degli inquinanti Il campione di sangue verrà centrifugato, il siero verrà quindi raccolto e conservato a -20 C fino all'analisi delle diossine nel sangue. La 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-diossina (TCDD) e il policlorobifenile 118 (PCB118) saranno misurati nel sangue mediante gascromatografia accoppiata con spettrometria di massa ad alta risoluzione (GC-HR-MS).

Per il monitoraggio biologico dell'esposizione agli IPA, l'1-idrossipirene (1-OHP) sarà misurato nelle urine utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa ad alte prestazioni (LC-MS-MS)

B. Valutazione dei marcatori infiammatori e di attivazione AhR

• Le PBMC verranno isolate da un campione di sangue da 20 ml utilizzando un protocollo di gradiente Ficoll® standard. Le cellule ed i sieri isolati verranno aliquotati e congelati per successivi esperimenti sulla via di segnalazione dell'AhR.
• Il test immunoassorbente legato all'enzima (ELISA) verrà utilizzato per misurare le citochine proinfiammatorie IL1β, TNFα, IL23, IL17 e IFNγ.
• La concentrazione di malondialdeide (MDA) sarà determinata utilizzando il metodo ELISA come biomarker per la perossidazione lipidica, che indica il livello di stress ossidativo causato dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS).
• Gli anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromo (CD4, CD25, CD127, FOXP3, Il17) verranno utilizzati nel sorter cellulare attivato a fluorescenza (FACS) per valutare il numero e il rapporto delle diverse popolazioni linfocitarie nelle PBMC. L'indagine si concentrerà sui livelli Th17 e Treg.
• Il FACS verrà utilizzato per valutare l'espressione di CYP1A1 e CYP1B1, che sono prototipi di geni bersaglio AhR, nei PBMC dopo targeting specifico.
• I livelli di espressione delle frazioni attive di AhR e NfkB saranno determinati mediante tecnica di immunofluorescenza diretta.
• Le PBMC verranno coltivate con anti-CD3+/-BaP (50 nM) in un incubatore cellulare (37°C, 5% CO2+ umidità controllata) per 48-72 ore. I parametri di interesse, inclusi lo stress ossidativo, le citochine proinfiammatorie e la valutazione della via AhR, saranno rivalutati dopo la riattivazione dei linfociti mediante anti-CD3 in presenza o assenza di BaP.