Envolvimento de Poluentes na Dermatite Atópica e Psoríase (DIAhR)

I. Introdução A poluição é um componente significativo do expossoma, com ligações estabelecidas à saúde humana. Em 2019, estimou-se que a poluição foi responsável por 9 milhões de mortes prematuras, tornando-a o quarto principal fator de risco de mortalidade em todo o mundo. Nos últimos 20 anos, as mortes relacionadas com a poluição aumentaram 66%. Isto deve-se à industrialização, à urbanização descontrolada, ao crescimento populacional, à queima de combustíveis fósseis e à falta de políticas restritivas em algumas regiões.

A camada cutânea é composta por uma complexa rede de células que formam uma barreira mecânica e biológica essencial para a manutenção da integridade e homeostase do organismo. A poluição pode prejudicar diretamente esta função ao atravessar a barreira ou entrar na circulação sistêmica por inalação ou ingestão.

A dermatite atópica (DA) e a psoríase são doenças inflamatórias crônicas da pele com origens multifatoriais, incluindo predisposição genética, desregulação imunológica e fatores ambientais. Estudos epidemiológicos demonstraram uma correlação positiva entre a poluição atmosférica e o desenvolvimento destas doenças.

Dada a sua elevada prevalência e o impacto dos sintomas na qualidade de vida dos pacientes, uma melhor compreensão do expossoma nestas doenças representa um grande desafio.

Estudos experimentais demonstraram que a via do receptor de hidrocarbonetos aromáticos (AhR) desempenha um papel significativo no impacto dos poluentes na psoríase e na DA. AhR é um fator de transcrição envolvido na resposta a poluentes ambientais, que permanece inativo em um complexo citoplasmático com proteínas chaperonas. Ao se ligar ao seu ligante, o AhR transloca-se para o núcleo e dimeriza com seu parceiro nuclear, Arnt. A ativação do complexo leva à expressão de numerosos genes que contêm uma sequência de consenso conhecida como elemento de resposta xenobiótica (XRE) em seus promotores.

Os ligantes ativadores do AhR compreendem xenobióticos encontrados no meio ambiente, principalmente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), dioxinas e os chamados compostos “semelhantes à dioxina” 12. Esta via de sinalização é considerada uma resposta “adaptativa” para desintoxicar o corpo de vários compostos exógenos. Entretanto, a ativação prolongada do AhR por tais agentes pode levar à desregulação do processo inflamatório, contribuindo para o desenvolvimento de psoríase e DA.

O receptor de aril hidrocarboneto (AhR) regula a transcrição dos citocromos 1A1 (CYP1A1) e 1B1 (CYP1B1), que são membros de uma família multigênica de enzimas envolvidas no metabolismo xenobiótico. Estas enzimas catalisam a bioativação de HAPs em metabólitos eletrofílicos levando à ativação de NFκB, um ator chave na resposta inflamatória. Durante seu ciclo catalítico, essas enzimas CYP1 produzem espécies reativas de oxigênio (ROS), que geram estresse oxidativo. Além disso, o AhR é responsável por regular a expressão de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL1β, TNFα, IL23, IL17 e IFNγ. Pode afetar diretamente o equilíbrio entre os linfócitos Th17 e as células T reguladoras (Tregs), contribuindo potencialmente para processos inflamatórios cutâneos.

No entanto, mais pesquisas são necessárias para definir melhor o papel do AhR na patogênese das dermatoses inflamatórias crônicas. Isto ajudará na gestão e prevenção destas doenças, especialmente quando factores de risco ambientais estão associados à predisposição.

II. Objetivo:

Supõe-se que a ativação do AhR com ligantes exógenos possa desempenhar um papel no desenvolvimento da dermatite atópica e da psoríase.

O objetivo principal é comparar os níveis de marcadores de ativação da via AhR entre casos e controles.

Os objetivos secundários incluem correlacionar a exposição ambiental aos ligantes AhR com a gravidade da doença nos pacientes.

Por fim, compararemos a expressão de marcadores inflamatórios e de ativação de AhR em cultura de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) após estimulação in vitro com benzo(a)pireno.

III. Material e métodos:

Estaremos realizando um estudo caso-controle:

• Caso: Pacientes com dermatose inflamatória crônica correspondente a psoríase ou dermatite atópica.
• Controles: Pessoas que consultam o serviço de dermatologia e que não apresentam essas patologias.

Todos os participantes, incluindo pacientes e controles, serão submetidos a consulta/hospitalização e testes biológicos como parte de seus cuidados médicos habituais. Os procedimentos realizados como parte do protocolo não interferirão nos seus cuidados.

Será coletada uma amostra de 10 ml de sangue para análise toxicológica. Serão coletados 20 ml de sangue para avaliação de marcadores inflamatórios e de ativação de AhR.

A. Medição de poluentes A amostra de sangue será centrifugada, o soro será então coletado e armazenado a -20 C até que as dioxinas sanguíneas sejam analisadas. 2,3,7,8-tétraclorodibenzo-p-dioxina (TCDD) e policlorobifenil 118 (PCB118) serão medidos no sangue por meio de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa de alta resolução (GC-HR-MS).

Para monitoramento biológico da exposição a PAHs, 1-hidroxipireno (1-OHP) será medido na urina usando cromatografia líquida de alta eficiência-espectrometria de massa (LC-MS-MS)

B. Avaliação de marcadores inflamatórios e de ativação de AhR

• As PBMCs serão isoladas de uma amostra de sangue de 20mL usando um protocolo padrão de gradiente Ficoll®. As células e soros isolados serão divididos em alíquotas e congelados para experimentos subsequentes na via de sinalização do AhR.
• O ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) será usado para medir as citocinas pró-inflamatórias IL1β, TNFα, IL23, IL17 e IFNγ.
• A concentração de malondialdeído (MDA) será determinada utilizando o método ELISA como biomarcador de peroxidação lipídica, que indica o nível de estresse oxidativo causado por espécies reativas de oxigênio (ROS).
• Anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo (CD4, CD25, CD127, FOXP3, Il17) serão usados ​​no classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) para avaliar os números e proporções de diferentes populações de linfócitos em PBMCs. A investigação se concentrará nos níveis Th17 e Treg.
• FACS será usado para avaliar a expressão de CYP1A1 e CYP1B1, que são protótipos de genes alvo de AhR, em PBMCs após direcionamento específico.
• Os níveis de expressão das frações ativas de AhR e NfkB serão determinados pela técnica de imunofluorescência direta.
• PBMCs serão cultivadas com anti-CD3+/-BaP (50 nM) em uma incubadora de células (37°C, 5% de umidade controlada por CO2+) por 48-72 horas. Os parâmetros de interesse, incluindo estresse oxidativo, citocinas pró-inflamatórias e avaliação da via AhR, serão reavaliados após reativação de linfócitos por anti-CD3 na presença ou ausência de BaP.