Účast polutantů u atopické dermatitidy a psoriázy (DIAhR)

I. Úvod Znečištění je významnou složkou expozice s prokázanou vazbou na lidské zdraví. V roce 2019 bylo znečištění podle odhadů zodpovědné za 9 milionů předčasných úmrtí, což z něj činí čtvrtý hlavní rizikový faktor úmrtnosti na celém světě. Za posledních 20 let se počet úmrtí souvisejících se znečištěním zvýšil o 66 %. Je to způsobeno industrializací, nekontrolovanou urbanizací, růstem populace, spalováním fosilních paliv a nedostatkem restriktivních politik v některých regionech.

Kožní vrstva je složena ze složité sítě buněk, které tvoří mechanickou a biologickou bariéru nezbytnou pro udržení integrity těla a homeostázy. Znečištění může tuto funkci přímo narušit tím, že překročí bariéru nebo se dostane do systémového oběhu vdechnutím nebo požitím.

Atopická dermatitida (AD) a psoriáza jsou chronické zánětlivé kožní stavy s multifaktoriálním původem, včetně genetické predispozice, imunitní dysregulace a faktorů prostředí. Epidemiologické studie prokázaly pozitivní korelaci mezi znečištěním ovzduší a rozvojem těchto onemocnění.

Vzhledem k jejich vysoké prevalenci a dopadu symptomů na kvalitu života pacientů představuje lepší porozumění exposomu u těchto onemocnění velkou výzvu.

Experimentální studie prokázaly, že dráha aromatického uhlovodíkového receptoru (AhR) hraje významnou roli v dopadu polutantů na psoriázu a AD. AhR je transkripční faktor zapojený do reakce na environmentální polutanty, který zůstává neaktivní v cytoplazmatickém komplexu s chaperonovými proteiny. Po navázání se svým ligandem se AhR translokuje do jádra a dimerizuje se svým jaderným partnerem Arnt. Aktivace komplexu vede k expresi mnoha genů, které ve svých promotorech obsahují konsenzuální sekvenci známou jako xenobiotický responzivní element (XRE).

Aktivátorové ligandy AhR zahrnují xenobiotika vyskytující se v životním prostředí, především polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), dioxiny a takzvané „dioxinové“ sloučeniny 12. Tato signální dráha je považována za „adaptivní“ reakci na detoxikaci těla od různých exogenních sloučenin. Avšak prodloužená aktivace AhR takovými činidly může vést k deregulaci zánětlivého procesu, což přispívá k rozvoji psoriázy a AD.

Aryl uhlovodíkový receptor (AhR) reguluje transkripci cytochromů 1A1 (CYP1A1) a 1B1 (CYP1B1), které jsou členy multigenové rodiny enzymů zapojených do metabolismu xenobiotik. Tyto enzymy katalyzují bioaktivaci HAP na elektrofilní metabolity vedoucí k aktivaci NFκB, klíčového hráče v zánětlivé odpovědi. Během svého katalytického cyklu tyto enzymy CYP1 produkují reaktivní formy kyslíku (ROS), které generují oxidační stres. Kromě toho je AhR zodpovědný za regulaci exprese prozánětlivých cytokinů, včetně IL1p, TNFa, IL23, IL17 a IFNy. Může přímo ovlivnit rovnováhu mezi Th17 lymfocyty a regulačními T buňkami (Tregs), potenciálně přispívat ke kožním zánětlivým procesům.

K lepší definici role AhR v patogenezi chronických zánětlivých dermatóz je však zapotřebí dalšího výzkumu. To pomůže při zvládání a prevenci těchto onemocnění, zejména pokud jsou rizikové faktory životního prostředí spojeny s predispozicí.

II. Objektivní:

Předpokládá se, že aktivace AhR exogenními ligandy může hrát roli ve vývoji atopické dermatitidy a psoriázy.

Hlavním cílem je porovnat hladiny aktivačních markerů AhR dráhy mezi případy a kontrolami.

Sekundární cíle zahrnují korelaci environmentální expozice ligandům AhR se závažností onemocnění u pacientů.

Nakonec porovnáme expresi zánětlivých a AhR aktivačních markerů v kultivovaných mononukleárních buňkách periferní krve (PBMC) po in vitro stimulaci benzo(a)pyrenem.

III. Materiály a metody:

Budeme provádět případovou kontrolní studii:

• Případ: Pacienti s chronickou zánětlivou dermatózou odpovídající psoriáze nebo atopické dermatitidě.
• Kontroly: Lidé konzultující dermatologické oddělení, kteří nemají tyto patologie.

Všichni účastníci, včetně pacientů a kontrol, podstoupí konzultaci/hospitalizaci a biologické testování jako součást své obvyklé lékařské péče. Postupy prováděné v rámci protokolu nebudou narušovat péči o ně.

Bude odebrán vzorek krve o objemu 10 ml na toxikologický rozbor. Bude odebráno 20 ml krve pro hodnocení zánětlivých a aktivačních markerů AhR.

A. Měření znečišťujících látek Vzorek krve bude odstředěn, sérum bude odebráno a skladováno při -20 C, dokud nejsou analyzovány dioxiny v krvi. 2,3,7,8-tétrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) a polychlorbifenyl 118 (PCB118) budou měřeny v krvi pomocí plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (GC-HR-MS).

Pro biologické monitorování expozice PAH bude 1-hydroxypyren (1-OHP) měřen v moči pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS-MS)

B. Hodnocení zánětlivých a aktivačních markerů AhR

• PBMC budou izolovány z 20ml krevního vzorku pomocí standardního gradientového protokolu Ficoll®. Izolované buňky a séra budou rozděleny na alikvoty a zmraženy pro následné experimenty na AhR signální dráze.
• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bude použit k měření prozánětlivých cytokinů IL1β, TNFα, IL23, IL17 a IFNγ.
• Koncentrace malondialdehydu (MDA) bude stanovena metodou ELISA jako biomarker peroxidace lipidů, který udává úroveň oxidačního stresu způsobeného reaktivními formami kyslíku (ROS).
• Monoklonální protilátky konjugované s fluorochromem (CD4, CD25, CD127, FOXP3, 1117) budou použity ve fluorescenčně aktivovaném třídiči buněk (FACS) k posouzení počtu a poměrů různých populací lymfocytů v PBMC. Vyšetřování se zaměří na hladiny Th17 a Treg.
• FACS bude použit k hodnocení exprese CYP1A1 a CYP1B1, což jsou prototypy cílových genů AhR, v PBMC po specifickém cílení.
• Hladiny exprese aktivních frakcí AhR a NfkB budou stanoveny pomocí přímé imunofluorescenční techniky.
• PBMC budou kultivovány s anti-CD3+/-BaP (50 nM) v buněčném inkubátoru (37 °C, 5% CO2+ kontrolovaná vlhkost) po dobu 48-72 hodin. Požadované parametry, včetně oxidačního stresu, prozánětlivých cytokinů a hodnocení AhR dráhy, budou znovu posouzeny po reaktivaci lymfocytů anti-CD3 v přítomnosti nebo nepřítomnosti BaP.