Udział substancji zanieczyszczających w atopowym zapaleniu skóry i łuszczycy (DIAhR)

I. Wprowadzenie Zanieczyszczenia są istotnym składnikiem ekssomu i mają ustalone powiązania ze zdrowiem człowieka. Szacuje się, że w 2019 r. zanieczyszczenia były odpowiedzialne za 9 milionów przedwczesnych zgonów, co czyni je czwartym co do wielkości czynnikiem ryzyka śmiertelności na świecie. W ciągu ostatnich 20 lat liczba zgonów związanych z zanieczyszczeniami wzrosła o 66%. Jest to spowodowane industrializacją, niekontrolowaną urbanizacją, wzrostem liczby ludności, spalaniem paliw kopalnych i brakiem restrykcyjnej polityki w niektórych regionach.

Warstwa skórna składa się ze złożonej sieci komórek tworzących barierę mechaniczną i biologiczną niezbędną do utrzymania integralności i homeostazy organizmu. Zanieczyszczenia mogą bezpośrednio zaburzyć tę funkcję poprzez przekroczenie bariery lub przedostanie się do krążenia ogólnoustrojowego poprzez wdychanie lub spożycie.

Atopowe zapalenie skóry (AZS) i łuszczyca to przewlekłe choroby zapalne skóry o wieloczynnikowym pochodzeniu, w tym predyspozycjach genetycznych, rozregulowaniu układu odpornościowego i czynnikach środowiskowych. Badania epidemiologiczne wykazały pozytywną korelację pomiędzy zanieczyszczeniem powietrza a rozwojem tych chorób.

Biorąc pod uwagę ich wysoką częstość występowania i wpływ objawów na jakość życia pacjentów, lepsze zrozumienie ekspozycji na te choroby stanowi główne wyzwanie.

Badania eksperymentalne wykazały, że szlak receptora węglowodorów aromatycznych (AhR) odgrywa znaczącą rolę w wpływie zanieczyszczeń na łuszczycę i AZS. AhR jest czynnikiem transkrypcyjnym biorącym udział w odpowiedzi na zanieczyszczenia środowiska, który pozostaje nieaktywny w kompleksie cytoplazmatycznym z białkami opiekuńczymi. Po związaniu się ze swoim ligandem AhR przemieszcza się do jądra i dimeryzuje ze swoim partnerem jądrowym, Arnt. Aktywacja kompleksu prowadzi do ekspresji wielu genów, które zawierają w swoich promotorach sekwencję konsensusową znaną jako element odpowiedzi ksenobiotycznej (XRE).

Ligandy aktywujące AhR obejmują ksenobiotyki występujące w środowisku, przede wszystkim wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), dioksyny i tak zwane związki „dioksynopodobne” 12. Ten szlak sygnalizacyjny jest uważany za reakcję „adaptacyjną” mającą na celu detoksykację organizmu z różnych związków egzogennych. Jednakże długotrwała aktywacja AhR przez takie środki może prowadzić do rozregulowania procesu zapalnego, przyczyniając się do rozwoju łuszczycy i AZS.

Receptor węglowodoru arylowego (AhR) reguluje transkrypcję cytochromów 1A1 (CYP1A1) i 1B1 (CYP1B1), które należą do wielogenowej rodziny enzymów biorących udział w metabolizmie ksenobiotyków. Enzymy te katalizują bioaktywację HAP do elektrofilowych metabolitów, co prowadzi do aktywacji NFκB, kluczowego uczestnika odpowiedzi zapalnej. Podczas cyklu katalitycznego te enzymy CYP1 wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS), które generują stres oksydacyjny. Ponadto AhR odpowiada za regulację ekspresji cytokin prozapalnych, w tym IL1β, TNFα, IL23, IL17 i IFNγ. Może bezpośrednio wpływać na równowagę pomiędzy limfocytami Th17 a limfocytami T regulatorowymi (Treg), potencjalnie przyczyniając się do procesów zapalnych skóry.

Konieczne są jednak dalsze badania, aby lepiej określić rolę AhR w patogenezie przewlekłych dermatoz zapalnych. Pomoże to w leczeniu i zapobieganiu tym chorobom, zwłaszcza gdy z predyspozycjami powiązane są środowiskowe czynniki ryzyka.

II. Cel:

Przypuszcza się, że aktywacja AhR za pomocą egzogennych ligandów może odgrywać rolę w rozwoju atopowego zapalenia skóry i łuszczycy.

Głównym celem jest porównanie poziomów markerów aktywacji szlaku AhR pomiędzy przypadkami i grupą kontrolną.

Cele drugorzędne obejmują korelację narażenia środowiskowego na ligandy AhR z ciężkością choroby u pacjentów.

Na koniec porównamy ekspresję markerów stanu zapalnego i aktywacji AhR w hodowanych komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) po stymulacji in vitro benzo(a)pirenem.

III. Materiał i metody:

Będziemy przeprowadzać badanie kliniczno-kontrolne:

• Przypadek: Pacjenci z przewlekłą zapalną dermatozą odpowiadającą łuszczycy lub atopowemu zapaleniu skóry.
• Kontrola: Osoby konsultujące się na oddziale dermatologicznym, które nie mają tych patologii.

Wszyscy uczestnicy, w tym pacjenci i grupa kontrolna, zostaną poddani konsultacjom/hopitalizacji i badaniom biologicznym w ramach zwykłej opieki medycznej. Procedury wykonywane w ramach protokołu nie będą zakłócać ich opieki.

Do analizy toksykologicznej zostanie pobrana próbka 10 ml krwi. W celu oceny markerów stanu zapalnego i aktywacji AhR zostanie pobrane 20 ml krwi.

A. Pomiar zanieczyszczeń Próbka krwi zostanie odwirowana, następnie pobrana zostanie surowica i przechowywana w temperaturze -20°C do czasu analizy dioksyn we krwi. 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioksyna (TCDD) i polichlorobifenyl 118 (PCB118) będą oznaczane we krwi za pomocą chromatografii gazowej połączonej ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (GC-HR-MS).

Do celów biologicznego monitorowania narażenia na WWA, 1-hydroksypiren (1-OHP) będzie oznaczany w moczu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC-MS-MS).

B. Ocena markerów stanu zapalnego i aktywacji AhR

• PBMC będą izolowane z 20 ml próbki krwi przy użyciu standardowego protokołu gradientu Ficoll®. Wyizolowane komórki i surowice zostaną podzielone na porcje i zamrożone do kolejnych eksperymentów na szlaku sygnałowym AhR.
• Do pomiaru poziomu cytokin prozapalnych IL1β, TNFα, IL23, IL17 i IFNγ zostanie zastosowany test immunoenzymatyczny (ELISA).
• Stężenie dialdehydu malonowego (MDA) będzie oznaczane metodą ELISA jako biomarker peroksydacji lipidów, który wskazuje poziom stresu oksydacyjnego wywołanego przez reaktywne formy tlenu (ROS).
• Przeciwciała monoklonalne skoniugowane z fluorochromem (CD4, CD25, CD127, FOXP3, Il17) zostaną wykorzystane w sortowniku komórek aktywowanym fluorescencją (FACS) w celu oceny liczby i proporcji różnych populacji limfocytów w PBMC. Dochodzenie skupi się na poziomach Th17 i Treg.
• FACS zostanie wykorzystany do oceny ekspresji CYP1A1 i CYP1B1, które są prototypami docelowych genów AhR, w PBMC po specyficznym ukierunkowaniu.
• Poziomy ekspresji aktywnych frakcji AhR i NfkB zostaną określone przy użyciu techniki immunofluorescencji bezpośredniej.
• PBMC będą hodowane z anty-CD3+/-BaP (50 nM) w inkubatorze komórkowym (37°C, wilgotność kontrolowana 5% CO2+) przez 48-72 godziny. Interesujące parametry, w tym stres oksydacyjny, cytokiny prozapalne i ocena szlaku AhR, zostaną ponownie ocenione po reaktywacji limfocytów przez anty-CD3 w obecności lub nieobecności BaP.