Участие загрязнителей в развитии атопического дерматита и псориаза (DIAhR)

I. Введение Загрязнение является важным компонентом воздействия, имеющим установленную связь со здоровьем человека. По оценкам, в 2019 году загрязнение стало причиной 9 миллионов преждевременных смертей, что сделало его четвертым по значимости фактором риска смертности во всем мире. За последние 20 лет количество смертей, связанных с загрязнением окружающей среды, увеличилось на 66%. Это связано с индустриализацией, неконтролируемой урбанизацией, ростом населения, сжиганием ископаемого топлива и отсутствием ограничительной политики в некоторых регионах.

Кожный слой состоит из сложной сети клеток, которые образуют механический и биологический барьер, необходимый для поддержания целостности и гомеостаза организма. Загрязнение может непосредственно нарушить эту функцию, пересекая барьер или попадая в системный кровоток через вдыхание или проглатывание.

Атопический дерматит (АД) и псориаз представляют собой хронические воспалительные заболевания кожи многофакторного происхождения, включая генетическую предрасположенность, иммунную дисрегуляцию и факторы окружающей среды. Эпидемиологические исследования показали положительную корреляцию между загрязнением воздуха и развитием этих заболеваний.

Учитывая их высокую распространенность и влияние симптомов на качество жизни пациентов, лучшее понимание воздействия этих заболеваний представляет собой серьезную проблему.

Экспериментальные исследования показали, что путь рецептора ароматических углеводородов (AhR) играет значительную роль во влиянии загрязняющих веществ на псориаз и БА. AhR представляет собой фактор транскрипции, участвующий в ответе на загрязнители окружающей среды, который остается неактивным в цитоплазматическом комплексе с белками-шаперонами. При связывании со своим лигандом AhR перемещается в ядро ​​и димеризуется со своим ядерным партнером Arnt. Активация комплекса приводит к экспрессии многочисленных генов, которые содержат в своих промоторах консенсусную последовательность, известную как элемент ответа ксенобиотика (XRE).

Лигандами-активаторами AhR являются ксенобиотики, встречающиеся в окружающей среде, в первую очередь полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), диоксины и так называемые «диоксиноподобные» соединения 12. Этот сигнальный путь считается «адаптивной» реакцией на детоксикацию организма от различных экзогенных соединений. Однако длительная активация АхР такими агентами может привести к дерегуляции воспалительного процесса, способствуя развитию псориаза и АД.

Арильный углеводородный рецептор (AhR) регулирует транскрипцию цитохромов 1A1 (CYP1A1) и 1B1 (CYP1B1), которые являются членами мультигенного семейства ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков. Эти ферменты катализируют биоактивацию HAP в электрофильные метаболиты, что приводит к активации NFκB, ключевого игрока в воспалительной реакции. Во время своего каталитического цикла эти ферменты CYP1 производят активные формы кислорода (АФК), которые вызывают окислительный стресс. Кроме того, AhR отвечает за регуляцию экспрессии провоспалительных цитокинов, включая IL1β, TNFα, IL23, IL17 и IFNγ. Он может напрямую влиять на баланс между Th17-лимфоцитами и регуляторными Т-клетками (Treg), потенциально способствуя кожным воспалительным процессам.

Однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы лучше определить роль AhR в патогенезе хронических воспалительных дерматозов. Это поможет в лечении и профилактике этих заболеваний, особенно когда факторы риска окружающей среды связаны с предрасположенностью.

II. Цель:

Предполагается, что активация AhR экзогенными лигандами может играть роль в развитии атопического дерматита и псориаза.

Основная цель — сравнить уровни маркеров активации пути AhR между случаями и контролем.

Вторичные цели включают корреляцию воздействия лигандов AhR в окружающей среде с тяжестью заболевания у пациентов.

Наконец, мы сравним экспрессию маркеров воспаления и активации AhR в культивируемых мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) после стимуляции in vitro бензо(а)пиреном.

III. Материал и методы:

Мы проведем исследование случай-контроль:

• Случай: пациенты с хроническим воспалительным дерматозом, соответствующим псориазу или атопическому дерматиту.
• Контроль: Люди, обращающиеся в дерматологическое отделение и не имеющие этих патологий.

Все участники, включая пациентов и контрольную группу, пройдут консультацию/госпитализацию и биологическое тестирование в рамках обычного медицинского ухода. Процедуры, выполняемые в рамках протокола, не помешают их уходу.

На токсикологический анализ возьмут пробу крови объемом 10 мл. Для оценки маркеров воспаления и активации AhR возьмут 20 мл крови.

А. Измерение загрязняющих веществ. Образец крови центрифугируется, затем собирается сыворотка и хранится при -20°C до тех пор, пока не будет проведен анализ диоксинов в крови. 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин (ТХДД) и полихлорбифенил 118 (ПХБ118) будут измеряться в крови с помощью газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией высокого разрешения (ГХ-ВР-МС).

Для биологического мониторинга воздействия ПАУ 1-гидроксипирен (1-ОНР) будет измеряться в моче с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС-МС).

B. Оценка маркеров воспаления и активации AhR

• РВМС будут выделены из образца крови объемом 20 мл с использованием стандартного протокола градиента Фиколла. Выделенные клетки и сыворотки будут разделены на аликвоты и заморожены для последующих экспериментов по сигнальному пути AhR.
• Иммуноферментный анализ (ИФА) будет использоваться для измерения провоспалительных цитокинов IL1β, TNFα, IL23, IL17 и IFNγ.
• Концентрацию малонового диальдегида (МДА) будут определять методом ИФА как биомаркера перекисного окисления липидов, который указывает на уровень окислительного стресса, вызванного активными формами кислорода (АФК).
• Моноклональные антитела, конъюгированные с флуорохромом (CD4, CD25, CD127, FOXP3, Il17), будут использоваться в сортировщике клеток, активируемых флуоресценцией (FACS), для оценки количества и соотношения различных популяций лимфоцитов в РВМС. Расследование будет сосредоточено на уровнях Th17 и Treg.
• FACS будет использоваться для оценки экспрессии CYP1A1 и CYP1B1, которые являются прототипами генов-мишеней AhR, в РВМС после специфического нацеливания.
• Уровни экспрессии активных фракций AhR и NfkB будут определять с использованием метода прямой иммунофлуоресценции.
• РВМС будут культивировать с анти-CD3+/-BaP (50 нМ) в клеточном инкубаторе (37°C, контролируемая влажность 5% CO2+) в течение 48-72 часов. Интересующие параметры, включая окислительный стресс, провоспалительные цитокины и оценку пути AhR, будут повторно оценены после реактивации лимфоцитов анти-CD3 в присутствии или в отсутствие BaP.