Dokosaheksaeenihapon (DHA) annosvastetutkimus (DRI-DHA)

Dokosaheksaeenihappo (DHA) on elintärkeä solukalvojen rakenteelle, välttämätön aivojen ja silmien kehitykselle, sitä esiintyy korkeina pitoisuuksina kaikkialla aivoissa ja hermostossa, ja se on tärkeä lasten optimaalisen kognitiivisen kehityksen, sikiön kasvun kannalta raskauden aikana ja terveenä. rintamaitoa imetyksen aikana. DHA:n on myös osoitettu auttavan suojaamaan sydän- ja verisuonisairauksien primaarisia ja toissijaisia ​​oireita sekä silmänpohjan rappeutumista vastaan. Kuitenkin, pidetäänkö DHA:ta välttämättömänä ruokavaliossa, on edelleen kiistanalaista. Sillä välin Institute of Medicine (nykyisin National Academy of Medicine) asetti DHA:n esiasteen, alfalinoleenihapon (ALA) riittäväksi saannin terveille miehille ja naisille 1,1 g/d. Tutkijat uskovat, että hämmennys johtuu lähestymistavasta tutkia omega-3-rasvahappoja, erityisesti DHA-vaatimuksia. Näissä tutkimuksissa DHA:ta täydennetään, ja usein monimutkaisia, monitekijäisiä sairauksien tuloksia käytetään päätepisteinä. Näissä tutkimuksissa käytetyt DHA-annokset ovat usein subjektiivisia, ja osallistujilla, mukaan lukien kontrollit, on vaihteleva DHA-saanti ja -tasot. Väestön, kuten kasvissyöjien tai vegaanien, joiden taso on yhtä alhainen, täydentäminen olisi hyödyllistä. Klassisesti uskottiin, että kun DHA:ta kulutetaan, osa muuttuu "taaksepäin" eikosapentaeenihapoksi (EPA), joka sitten kerääntyy prosessissa, jota kutsutaan "retrokonversioksi". Kuitenkin käyttämällä uutta lähestymistapaa, jota kutsutaan yhdistespesifiseksi isotooppianalyysiksi (CSIA), tutkijat havaitsivat, että EPA:n nousu ei johdu ensisijaisesti retrokonversiosta, vaan pikemminkin pääasiassa ALA:sta peräisin olevasta EPA:n ruuhkasta. Alun perin CSIA:n jyrsijämalleissa osoittama ryhmä vahvisti samanlaisella mallinnolla, että DHA:n kulutus ihmisillä johtaa samaan EPA-ruuhkaan. Kriittisesti DHA aiheuttaa ruuhkaa EPA:n aineenvaihdunnassa, ja ravinnon ALA näyttää olevan välttämätön tälle ruuhkalle. Siten EPA:n lisääntyminen edustaa biokemiallista palautereittiä, joka hidastaa DHA:n synteesiä vasteena riittävälle DHA:lle.

Merkitys: Kun määritetään tarkasti pienin DHA-määrä, joka tarvitaan tämän palautemekanismin aktivoimiseen, se voi olla hyödyllistä tulevaa DHA-vaatimusten arviointia varten. Lisäksi epävirallisiin suosituksiin ehdotettujen määrien ongelmana on, että jos maailman väestö kuluttaisi näitä määriä, se olisi ympäristön kannalta huolestuttavaa, koska tämä ravinne on ekologisesti herkkä, sillä sen päälähde tulee jo ennestään stressaantuneista valtameren kalakannoista, mikä rohkaisee kestämättömiin kalastuskäytäntöihin. Ympäristönsuojelijat ja tutkijat ovat sanoneet aiheuttavan oikeutettuja ilmasto- ja terveysongelmia.

Hypoteesi: Annos, jolla EPA kasvaa DHA:n lisääntyessä, on piste, jossa venyminen hidastuu, mikä osoittaa, että läsnä on merkittävä takaisinkytkentäreitti.

Tavoitteet: 1. Määrittää DHA:n annos-vasteen EPA:n lisäämiseksi. 2. Tutki DHA-annos ja aika, joka lisää EPA:ta käyttämällä CSIA:ta. 3. EPA:n, DPAn-3:n ja DHA:n kierto- ja hävikkiasteen mittaamiseen. 4. Tarjoa tietoja tutkivaan analyysiin liittyen PUFA-aineenvaihduntaan, ALA:n kulutukseen ja sen vaikutukseen EPA- ja DHA-tasoihin sekä DHA:n vaikutuksiin sairauteen liittyviin biomarkkereihin, C-reaktiiviseen proteiiniin (CRP) ja veren hyytymiseen.

Kokeilusuunnittelu: Periaatetutkijat Dr. Richard Bazinet ja tohtori John Sievenpiper sekä tutkijat, Drs. David Jenkins ja Adam Metherel yhdessä tohtoriopiskelija Amy Symingtonin kanssa suorittavat kaksoissokkoutetun, lumekontrolloidun, annos-vaste-lisätutkimuksen. Seitsemänkymmentäkaksi tervettä vegaania tai kasvissyöjää, jotka ovat 18–50-vuotiaita, jaetaan satunnaisesti yhteen kuudesta ryhmästä. Ennen satunnaistamista osallistujat käyvät läpi 2 viikon sisäänkäynnistysvaiheen kerätäkseen kyselytietonsa. Satunnaistettuaan jokainen ryhmä ottaa DHA-lisäaineita joko 0 mg (plasebo), 100 mg, 200 mg, 400 mg, 800 mg ja 1000 mg päivässä 8 viikon ajan. Nämä annokset edustavat DHA-saannin vaihteluväliä, joka kattaa väestön keskimääräisen saannin (<100 mg/d), usein suositeltuja saanteja (250–500 mg/d) ja DHA:n saantitasoja, joiden tiedetään lisäävän plasman EPA-tasoja (1000 mg/d). Kyselylomakkeella saadaan tietoa arviolta ALA:n, EPA:n ja DHA:n saannista ennen ja jälkeen täydennysjakson. 3 päivän punnittu ruokavaliopäiväkirja toimitetaan, jotta saadaan selville ravinnon saanti täydennysjakson aikana ALA-kulutuksen mittaamiseksi. Osallistujia pyydetään pidättymään DHA-rikkaista ruoista lisäravinteen aikana. Tämä ei ole ongelma, koska tämä väestö ei yleensä kuluta DHA-rikasta ruokaa. Välttämättömän rasvahapon ALA-saannin lähtötilanne arvioidaan kyselylomakkeella ja varmistetaan verinäytteillä.

Osallistujat: Tutkimukseen otetaan mukaan 72 tervettä kasvissyöjää ja vegaania, jotta EPA- ja DHA-tasot ovat mahdollisimman alhaisia. Poissulkemiskriteerit ovat seuraavat: EPA- ja/tai DHA-lisän nauttiminen viimeisen kuuden kuukauden aikana, DHA:ta on vähintään 3 % plasman kokonaislipidiarvoista, BMI <18 kg/m2 tai >30 kg/m2, ovat vaihdevuosien aikana tai postitse. -vaihdevuodet, raskaana tai imettävät, krooniset tai tarttuvat sairaudet (kuten multippeliskleroosi, munuais- ja tulehduksellinen suolistosairaus, tyypin 2 diabetes, syöpä tai sydänsairaus), kroonisten tulehduskipulääkkeiden käyttö, lipidejä säätelevien lääkkeiden käyttö, hypertriglyseridemia (> 4 mmol/l) tai hyperkolesterolemia (LDL-C > 5 mmol/l), ennakoi suuria elämäntapamuutoksia, tupakoitsijaa, runsasta alkoholin käyttäjää (>3 annosta/vrk) ja suurta leikkausta tai on osallistunut interventiotutkimukseen viimeisen kuuden aikana kuukaudet. Nämä poissulkemistiedot ovat linjassa aikaisempien meta-analyysien ja n-3-lisäkokeiden kanssa, joissa on käytetty yllä olevia poissulkemiskriteereitä, koska ne vaikuttavat n-3 PUFA-aineenvaihduntaan. Suostumuslomakkeen allekirjoittaneille osallistujille, jotka myöhemmin katsotaan kelpaamattomiksi painoindeksin tai prosentuaalisen DHA-tason vuoksi, tiedotetaan sähköpostitse ja/tai puhelimitse. Tämä on selitetty suostumuslomakkeessa.

Rasvahappoanalyysit: Verinäytteet perus- ja seurantakokouksia varten otetaan yön yli 12 tunnin paaston jälkeen. Verinäytteet otetaan päivinä 0, 3, 7, 14, 28 ja 56. Näytteet ottaa rekisteröity sairaanhoitaja. Kokoverinäytteet tallennetaan ja tallennetaan jokaiselta osallistujalta. Tämän jälkeen loput kokoverinäytteet kustakin osallistujasta sentrifugoidaan ja plasma ja punasolut (RBC) eristetään kustakin näytteestä. Niitä säilytetään -80 °C:ssa ilmatiiviissä astiassa, kunnes niitä tarvitaan analysointiin. Plasma- ja punasolunäytteiden rasvahappopitoisuudet analysoidaan käyttämällä kaasukromatografia (GC)-liekki-ionisaatiodetektiota ja delta-hiili-13 (δ13C) määritetään GC-isotooppisuhdemassaspektrometrialla. Plasma ja punasolut analysoidaan siten, että ensisijaisena tuloksena on muutokset plasman EPA-tasoissa ja toissijaisena tuloksena plasman δ13C EPA-allekirjoitus, joka mitataan yhdistespesifisellä isotooppianalyysillä (CSIA). EPA:n δ13C-allekirjoitus mitataan myös sen varmistamiseksi, että se on linjassa plasman ALA:n δ13C-allekirjoituksen kanssa, ei DHA-lisän kanssa.

Näytteen koko: Teho laskettiin tulosten perusteella kirjallisuudesta, jossa on johdonmukaisesti raportoitu muutoksia plasman EPA:ssa DHA-lisän jälkeen 6 viikon ajan 12 koehenkilöllä, ja se on yhdenmukainen havainteidemme kanssa. Käyttämällä keskiarvoja, standardipoikkeamia ja otoskokoja Metherelin ym. tutkimuksesta vuonna 2019 ja näistä kahdesta aikaisemmasta tutkimuksesta, alfa = 0,05 ja haluttu potenssi 0,8, määritimme hieman yli 9:n otoskoot riittäviksi tuottamaan tilastollisesti merkitsevän vaikutuksen. Sellaisenaan ennustetun 20–25 prosentin keskeyttämisprosentin huomioon ottamiseksi rekrytoimme 12 osallistujaa varmistaaksemme, että meillä on asianmukaiset tehot ensisijaiseen tulokseemme.

Toissijainen analyysi: Rekrytoinnista riippuen tutkijat tutkivat, reagoivatko miehet ja naiset eri tavalla tutkivassa analyysissä, ja he ymmärtävät, että he eivät ehkä pysty havaitsemaan mahdollisesti todellisia, mutta pieniä sukupuoleen liittyviä eroja. Tutkijat käyttävät kerättyjä kokoverinäytteitä FADS1-, FADS2-, ELOVL2- ja ELOVL5-isoformien määrittämiseen, joiden on osoitettu vaikuttavan veren EPA- ja DHA-tasoihin osa-analyysinä.

Tutkijat toimittavat myös tietoja lisäanalyysien tekemiseen liittyen n-3 PUFA:n kiertoon ja hävikkiin, osallistujien ALA:n kulutukseen ja sen vaikutukseen n-3 PUFA:n aineenvaihduntaan. Lisäksi määritetään joitakin hyödyllisiä tuloksia, joita DHA-lisän kanssa voi esiintyä nykyisen tutkimuksen mukaan, mukaan lukien verenpaine, syke, triglyseridit sekä LDL-, HDL- ja kokonaiskolesteroli.

Rekrytointi: Osallistujat rekrytoidaan sähköpostin ja sosiaalisen median kautta erilaisiin kasvissyöjä/vegaaneihin keskittyviin ryhmiin ja organisaatioihin.

Antropometriset analyysit: Korkeus mitataan seinään asennettavalla stadionimittarilla.

Kehon paino arvioidaan palkkiasteikolla. Vyötärön ympärysmitta mitataan Heart and Stroke Foundation -metodologialla. Verenpaine (BP) ja leposyke mitataan. Tämän mittauksen keräämiseksi osallistujat pysyvät hiljaisessa, lämpötilasäädellyssä huoneessa vähintään 5 minuutin ajan leposykkeen ja verenpaineen saavuttamiseksi. Sen jälkeen verenpaine mitataan oskilometrisesti käyttämällä OMRON Intellisense HEM-907 -laitetta JNC VII -kriteerien mukaisesti. Verenpaine mitataan kolmena rinnakkaisena, jolloin jokaista mittausta erottaa minuutti, ja kolmen mittauksen keskiarvo otetaan.

Biokemialliset analyysit: EPA:n ja DHA:n plasma- ja punasolunäytteet erotetaan sentrifugilla ja pakastetaan välittömästi -80 C:seen Toronton yliopistossa myöhempää analysointia varten. Vaikka plasma on tulosten pääasiallinen painopiste, sekä plasma- että punasolunäytteet analysoidaan vertailua varten GC-FID:llä EPA- ja DHA-tasojen määrittämiseksi ja δ13C analysoidaan GC-IRMS:llä.

Perus- ja seurantakysely: Jotta saataisiin arvioitua ALA:n, EPA:n ja DHA:n saantia sekä ennen lisäaikaa että sen jälkeen, osallistujille lähetetään sähköpostitse kyselylomake, joka täytetään ensimmäisen puhelin-/zoom-kokouksen jälkeen ja päivän viimeisen käynnin yhteydessä. 56.

Tilastollinen analyysi

Ensisijaiset tulokset. Plasma- ja punasolunäytteet (RBC) analysoidaan käyttämällä GC-FID:tä n-3 PUFA-pitoisuuksien määrittämiseksi kussakin ryhmässä. Tilastollinen analyysi suoritetaan kaksisuuntaisella ANOVA:lla (annos x aika) ja toistetaan ajoissa vuorovaikutuksen ja/tai päävaikutusten määrittämiseksi. Lisäksi EPA-tasojen nousu analysoidaan segmentoidulla regressiolla (tai rajapisteanalyysillä), kuten tehdään indikaattoriaminohappohapetustekniikalla annosten välillä ja jokaisen aikapisteen sisällä, jotta voidaan tunnistaa DHA-lisäannos, joka johtaa äkilliseen nousuun. EPA-tasoissa DHA-annos, joka käynnistää takaisinkytkennän eston. Toistuvia mittauksia post hoc Tukey-testillä määritetään merkittävät erot DHA-% ja EPA-%:ssa käyntien välillä sekä ryhmien välillä. Games-Howell-testi suoritetaan Tukey-testin aikana, jos ryhmässä sattuu olemaan epätasaisia ​​​​osallistujia keskeyttämisen vuoksi.

Toissijaiset tulokset. δ13C analysoidaan käyttämällä GC-IRMS:ää. EPA:n δ13C-allekirjoitus mitataan sen varmistamiseksi, että se on linjassa plasman ALA:n δ13C-allekirjoituksen kanssa, ei DHA-lisän kanssa. EPA:n, DPAn-3:n ja DHA:n kiertonopeudet ja puoliintumisajat lasketaan GraphPad Prism versiolla 10.0 ja EPA:n, DPAn-3:n ja DHA:n häviämisnopeus plasmasta nmol/ml/vrk käyttäen seuraavaa kaava: Jout = 0,693 CFA/t1/2.

Tutkimus- ja sitoutumistulokset. Toistuvien mittausten sekavaikutusmalleja käytetään arvioimaan muutoksia kaikissa tutkimustuloksissa ilman, että vääriä löytöjä valvotaan. Ryhmien väliset parivertailut suoritetaan käyttämällä Tukey-Kramer-säätöä tai muita sopivia tilastoja. ALA:n kulutuksen, sukupuolen ja geneettisen vaikutuksen muutosta tutkitaan ja verinäytteitä analysoidaan noudattamisen varalta.

Alaryhmäanalyysi. A priori -analyysi suoritetaan iän, sukupuolen, etnisen taustan, lähtötason BMI:n, vyötärön ympärysmitan, geneettisten varianttien ja ALA-kulutuksen perusteella.