Uno studio sulla risposta alla dose dell'acido docosaesaenoico (DHA) (DRI-DHA)

L'acido docosaesaenoico (DHA) è vitale per la struttura delle membrane cellulari, essenziale per lo sviluppo del cervello e degli occhi, presente in livelli elevati in tutto il cervello e nel sistema nervoso ed è importante per lo sviluppo cognitivo ottimale nei bambini, la crescita del feto durante la gravidanza e un sano latte materno durante l'allattamento. È stato inoltre dimostrato che il DHA aiuta a proteggere dai sintomi primari e secondari delle malattie cardiovascolari e della degenerazione maculare. Tuttavia, rimane controverso se il DHA sia considerato essenziale nella dieta. Nel frattempo, l’Institute of Medicine (ora National Academy of Medicine) ha fissato un apporto adeguato per il precursore del DHA, l’acido alfa-linolenico (ALA), a 1,6 g/giorno e 1,1 g/giorno rispettivamente per maschi e femmine sani. I ricercatori ritengono che la confusione derivi dall’approccio allo studio degli acidi grassi omega-3, in particolare dei requisiti di DHA. Per questi studi, il DHA viene integrato e spesso come endpoint vengono utilizzati esiti di malattie complesse e multifattoriali. Le dosi di DHA utilizzate in questi studi sono spesso soggettive e i partecipanti, compresi i controlli, hanno assunzioni e livelli di DHA variabili. Sarebbe utile integrare una popolazione, come i vegetariani o i vegani, i cui livelli sono altrettanto bassi. Classicamente, si credeva che quando si consuma DHA, una parte viene convertita "all'indietro" in acido eicosapentaenoico (EPA) che poi si accumula in un processo chiamato "retroconversione". Tuttavia, utilizzando un nuovo approccio chiamato analisi isotopica composto-specifica (CSIA), i ricercatori hanno osservato che l’aumento dell’EPA non deriva principalmente dalla retroconversione, ma piuttosto da un arretrato di EPA originato principalmente da ALA. Inizialmente dimostrato in modelli di roditori dal CSIA, il team ha confermato con modelli simili che il consumo di DHA negli esseri umani comporta lo stesso arretrato di EPA. Fondamentalmente, il DHA induce un ritardo nel metabolismo dell’EPA e l’ALA alimentare sembra essere essenziale per questo ritardo. Pertanto, l’aumento dell’EPA rappresenta un percorso di feedback biochimico che rallenta la sintesi di DHA in risposta a una quantità sufficiente di DHA.

Significato: determinando con precisione la quantità minima di DHA richiesta per attivare questo meccanismo di feedback, potrebbe essere utile per la stima futura dei requisiti di DHA. Inoltre, il problema con le quantità suggerite per le raccomandazioni non ufficiali è che se la popolazione mondiale dovesse consumare tali quantità sarebbe preoccupante dal punto di vista ambientale poiché questo nutriente è ecologicamente sensibile poiché la sua fonte principale proviene da stock ittici oceanici già stressati, incoraggiando pratiche di pesca non sostenibili. , qualcosa che secondo ambientalisti e ricercatori sta creando legittime preoccupazioni sul clima e sulla salute.

Ipotesi: la dose alla quale l'EPA aumenta con l'aumento del DHA è il punto in cui l'allungamento rallenta, indicando la presenza di un significativo percorso di feedback.

Obiettivi: 1. Determinare la dose-risposta del DHA per aumentare l'EPA. 2. Investigare la dose di DHA e il tempo che aumenta l'EPA utilizzando CSIA. 3. Misurare il turnover e i tassi di perdita di EPA, DPAn-3 e DHA. 4. Fornire dati per analisi esplorative relative al metabolismo dei PUFA, al consumo di ALA e al suo effetto sui livelli di EPA e DHA, nonché agli effetti del DHA sui biomarcatori correlati alla malattia, sulla proteina C-reattiva (CRP) e sulla coagulazione del sangue.

Disegno dello studio: i ricercatori co-principali Dr. Richard Bazinet e il Dr. John Sievenpiper e co-investigatori, Drs. David Jenkins e Adam Metherel, insieme alla dottoranda Amy Symington, condurranno uno studio di integrazione dose-risposta in doppio cieco, controllato con placebo. Settantadue vegani o vegetariani sani di età compresa tra 18 e 50 anni verranno assegnati in modo casuale a 1 dei 6 gruppi. Prima della randomizzazione, i partecipanti saranno sottoposti a una fase di rodaggio di 2 settimane per raccogliere i dati del questionario. Una volta randomizzato, ciascun gruppo assumerà integratori di DHA da 0 mg (placebo), 100 mg, 200 mg, 400 mg, 800 mg e 1000 mg al giorno nel corso di 8 settimane. Queste dosi rappresentano l’intervallo dei livelli di assunzione di DHA che comprende le assunzioni medie della popolazione (<100 mg/die), le assunzioni frequentemente raccomandate (250 – 500 mg/die) e i livelli di assunzione di DHA noti per aumentare i livelli plasmatici di EPA (1.000 mg/die). Verrà somministrato un questionario per ottenere informazioni relative all'assunzione approssimativa di ALA, EPA e DHA prima e dopo il periodo di integrazione. Verrà fornito un diario dietetico pesato di 3 giorni per ottenere l'assunzione di cibo nel corso del periodo di integrazione per valutare il consumo di ALA. Ai partecipanti verrà chiesto di astenersi da cibi ricchi di DHA durante il periodo di integrazione. Questo non sarà un problema poiché questa popolazione generalmente non consuma cibi ricchi di DHA. L'assunzione basale dell'acido grasso essenziale ALA sarà valutata tramite questionario e verificata mediante campioni di sangue.

Partecipanti: lo studio recluterà 72 vegetariani e vegani sani per consentire i livelli basali di EPA e DHA più bassi possibili. I criteri di esclusione sono i seguenti: consumo di integratori di EPA e/o DHA negli ultimi sei mesi, avere il 3% o più di DHA nei lipidi plasmatici totali, BMI <18 kg/m2 o >30 kg/m2, essere in menopausa o in post-menopausa -menopausa, gravidanza o allattamento, malattie croniche o trasmissibili (come sclerosi multipla, malattie renali e infiammatorie intestinali, diabete di tipo 2, cancro o malattie cardiache), uso di farmaci antinfiammatori cronici, uso di farmaci che controllano i lipidi, ipertrigliceridemia (> 4 mmol/l) o ipercolesterolemia (LDL-C >5 mmol/l), anticipano cambiamenti importanti nello stile di vita, fumatore, forte consumatore di alcol (>3 drink al giorno) e interventi chirurgici importanti o ha partecipato a uno studio di intervento negli ultimi sei mesi. Questi dati di esclusione sono in linea con le precedenti meta-analisi e gli studi di integrazione n-3 che hanno utilizzato i criteri di esclusione di cui sopra poiché influenzano il metabolismo dei PUFA n-3. I partecipanti che firmano il modulo di consenso e che vengono successivamente ritenuti non idonei a causa del BMI o della percentuale dei livelli di DHA verranno informati tramite e-mail e/o telefono. Ciò è spiegato nel modulo di consenso.

Analisi degli acidi grassi: i campioni di sangue per le riunioni di base e di follow-up verranno ottenuti dopo un digiuno notturno di 12 ore. I campioni di sangue verranno raccolti ai giorni 0, 3, 7, 14, 28 e 56. I campioni saranno raccolti da un'infermiera professionale. I campioni di sangue intero verranno salvati e archiviati da ciascun partecipante. Quindi, i rimanenti campioni di sangue intero di ciascun partecipante verranno centrifugati e il plasma e i globuli rossi (RBC) verranno isolati da ciascun campione. Verranno conservati a -80°C in un contenitore ermetico fino al momento dell'analisi. I campioni di plasma e globuli rossi verranno analizzati per le concentrazioni di acidi grassi utilizzando la gascromatografia (GC) con rilevamento della ionizzazione di fiamma e il delta carbonio-13 (δ13C) sarà valutato utilizzando la spettrometria di massa del rapporto isotopico GC. Il plasma e i globuli rossi saranno analizzati con i cambiamenti nei livelli plasmatici di EPA come risultato primario e la firma plasmatica δ13C EPA, misurata mediante analisi isotopica specifica del composto (CSIA), come risultato secondario. Verrà misurata anche la firma δ13C dell'EPA per verificare che sia in linea con la firma δ13C dell'ALA plasmatico e non dell'integratore DHA.

Dimensione del campione: la potenza è stata calcolata sulla base dei risultati della letteratura che ha costantemente riportato cambiamenti nell'EPA plasmatico in seguito all'integrazione di DHA per 6 settimane con 12 soggetti ed è coerente con i nostri risultati. Utilizzando le medie, le deviazioni standard e le dimensioni del campione dello studio Metherel et al del 2019 e di questi due studi precedenti, un alfa = 0,05 e una potenza desiderata di 0,8, abbiamo determinato dimensioni del campione di poco più di 9 come sufficienti per produrre un effetto statisticamente significativo. Pertanto, per tenere conto di un tasso di abbandono previsto del 20-25%, recluteremo 12 partecipanti per garantire di essere adeguatamente potenziati per il nostro risultato primario.

Analisi secondaria: a seconda del reclutamento, i ricercatori esamineranno se maschi e femmine rispondono in modo diverso in un'analisi esplorativa, riconoscendo che potrebbero non essere in grado di rilevare differenze potenzialmente reali, ma piccole legate al sesso. I ricercatori utilizzeranno campioni di sangue intero raccolti per determinare le isoforme FADS1, FADS2, ELOVL2 ed ELOVL5 che hanno dimostrato di influenzare i livelli ematici di EPA e DHA come sottoanalisi.

I ricercatori forniranno inoltre dati per eseguire ulteriori analisi relative al turnover e ai tassi di perdita degli n-3 PUFA, al consumo di ALA dei partecipanti e al suo effetto sul metabolismo degli n-3 PUFA. Inoltre, verranno determinati alcuni dei risultati benefici che possono verificarsi con l'integrazione di DHA secondo la ricerca attuale, tra cui pressione sanguigna, frequenza cardiaca, trigliceridi, LDL, HDL e colesterolo totale.

Reclutamento: i partecipanti verranno reclutati tramite e-mail e social media in vari gruppi e organizzazioni focalizzati sui vegetariani/vegani.

Analisi antropometriche: l'altezza sarà misurata con uno stadiometro montato a parete.

Il peso corporeo sarà valutato mediante bilancia a fascio. La circonferenza della vita sarà valutata utilizzando la metodologia Heart and Stroke Foundation. Verranno misurate la pressione sanguigna (BP) e la frequenza cardiaca a riposo. Per raccogliere questa misura, i partecipanti rimarranno seduti in una stanza tranquilla a temperatura controllata per almeno 5 minuti per raggiungere la frequenza cardiaca e la pressione arteriosa a riposo. Successivamente, la pressione arteriosa verrà misurata oscillometricamente utilizzando l'OMRON Intellisense HEM-907 secondo i criteri JNC VII. La pressione arteriosa verrà misurata tre volte, con ciascuna misurazione separata da un minuto, e verrà presa la media delle tre misurazioni.

Analisi biochimiche: i campioni di plasma e globuli rossi per EPA e DHA verranno separati mediante centrifuga e immediatamente congelati a -80 C presso l'Università di Toronto per analisi successive. Sebbene il plasma sia l'obiettivo principale per il risultato, sia i campioni di plasma che quelli di globuli rossi verranno analizzati per il confronto utilizzando GC-FID per determinare i livelli di EPA e DHA e il δ13C verrà analizzato utilizzando GC-IRMS.

Questionario di base e di follow-up: per ottenere un'assunzione approssimativa di ALA, EPA e DHA sia prima che dopo il periodo di integrazione, ai partecipanti verrà fornito un questionario via e-mail da compilare dopo il primo incontro telefonico/zoom e alla visita finale del giorno 56.

Analisi statistica

Risultati primari. I campioni di plasma e globuli rossi (RBC) verranno analizzati utilizzando GC-FID per determinare le concentrazioni di n-3 PUFA all'interno di ciascun gruppo. L'analisi statistica sarà effettuata mediante ANOVA a due vie (dose x tempo) con misure ripetute nel tempo per determinare l'interazione e/o gli effetti principali. Inoltre, l'aumento dei livelli di EPA sarà analizzato mediante regressione segmentata (o analisi breakpoint), come avviene con la tecnica di ossidazione degli aminoacidi indicatori tra le dosi e all'interno di ciascun punto temporale per identificare la dose di integrazione di DHA che si traduce in un aumento improvviso nei livelli di EPA, la dose di DHA che avvia l'inibizione del feedback. Verranno utilizzate misurazioni ripetute del test di Tukey post hoc per determinare differenze significative in DHA% ed EPA% tra le visite e tra i gruppi. Un test Games-Howell verrebbe somministrato durante il test Tukey se un gruppo dovesse avere un numero di partecipanti non pari a causa di abbandoni.

Risultati secondari. Il δ13C sarà analizzato utilizzando GC-IRMS. La firma δ13C dell'EPA sarà misurata per verificare che si allinei con la firma δ13C dell'ALA plasmatico e non dell'integratore DHA. I tassi di turnover e le emivite di EPA, DPAn-3 e DHA saranno calcolati da GraphPad Prism versione 10.0 e il tasso di perdita di EPA, DPAn-3 e DHA in nmol/ml/giorno dal plasma sarà calcolato utilizzando quanto segue formula: Jout = 0,693CFA/t1/2.

Risultati esplorativi e di adesione. Verranno utilizzati modelli a effetti misti a misure ripetute per valutare i cambiamenti in tutti i risultati esplorativi senza controllare il tasso di false scoperte. I confronti a coppie tra i gruppi verranno eseguiti utilizzando l'aggiustamento di Tukey-Kramer o altre statistiche appropriate. Verrà esplorata la modificazione degli effetti dovuta al consumo di ALA, al sesso e alla genetica e i campioni di sangue verranno analizzati per verificarne la conformità.

Analisi dei sottogruppi. L'analisi a priori sarà condotta per età, sesso, etnia, BMI basale, circonferenza vita basale, varianti genetiche e consumo di ALA.