Badanie reakcji na dawkę kwasu dokozaheksaenowego (DHA) (DRI-DHA)

Kwas dokozaheksaenowy (DHA) jest niezbędny dla struktury błon komórkowych, niezbędny do rozwoju mózgu i oczu, występuje w dużych ilościach w całym mózgu i układzie nerwowym i jest ważny dla optymalnego rozwoju poznawczego u dzieci, wzrostu płodu w czasie ciąży i zdrowego mleko matki podczas laktacji. Wykazano również, że DHA pomaga w ochronie przed pierwotnymi i wtórnymi objawami chorób układu krążenia, a także zwyrodnieniem plamki żółtej. Jednak to, czy DHA uważa się za niezbędny w diecie, pozostaje kontrowersyjne. Tymczasem Instytut Medycyny (obecnie Narodowa Akademia Medycyny) ustalił odpowiednie spożycie prekursora DHA, kwasu alfa-linolenowego (ALA), na odpowiednio 1,6 g/d i 1,1 g/d dla zdrowych mężczyzn i kobiet. Badacze uważają, że zamieszanie wynika z podejścia do badania kwasów tłuszczowych omega-3, zwłaszcza zapotrzebowania na DHA. W badaniach tych uzupełnia się DHA, a jako punkty końcowe często wykorzystuje się złożone, wieloczynnikowe wyniki choroby. Dawki DHA stosowane w tych badaniach są często subiektywne, a uczestnicy, w tym osoby kontrolne, spożywali i różnili się w poziomach DHA. Przydatne byłoby uzupełnianie populacji, np. wegetarian i wegan, których poziom jest podobnie niski. Klasycznie uważano, że gdy DHA jest spożywany, jego część jest przekształcana „wstecznie” w kwas eikozapentaenowy (EPA), który następnie gromadzi się w procesie zwanym „retrokonwersją”. Jednakże stosując nowatorskie podejście zwane analizą izotopów specyficznych dla związku (CSIA), badacze zaobserwowali, że wzrost EPA nie wynika głównie z retrokonwersji, ale raczej z zaległości w zakresie EPA pochodzącej głównie z ALA. Początkowo zespół CSIA wykazał to na modelach gryzoni, za pomocą podobnego modelowania potwierdził, że spożycie DHA u ludzi skutkuje takimi samymi zaległościami w EPA. Co najważniejsze, DHA powoduje opóźnienie w metabolizmie EPA, a dietetyczny ALA wydaje się być niezbędny do usunięcia tych zaległości. Zatem wzrost EPA stanowi szlak biochemicznego sprzężenia zwrotnego, który spowalnia syntezę DHA w odpowiedzi na wystarczającą ilość DHA.

Znaczenie: Precyzyjne określenie najniższej ilości DHA wymaganej do aktywacji mechanizmu sprzężenia zwrotnego może być przydatne do przyszłego oszacowania zapotrzebowania na DHA. Co więcej, problem z ilościami sugerowanymi w nieoficjalnych zaleceniach polega na tym, że spożycie tych ilości przez ludność światową byłoby groźne dla środowiska, ponieważ ten składnik odżywczy jest ekologicznie wrażliwy, a jego głównym źródłem są już wyczerpane zasoby ryb oceanicznych, co zachęca do niezrównoważonych praktyk połowowych , które zdaniem ekologów i badaczy stwarzają uzasadnione problemy klimatyczne i zdrowotne.

Hipoteza: Dawka, przy której EPA wzrasta wraz ze wzrostem DHA, to punkt, w którym wydłużenie spowalnia, co wskazuje na obecność istotnej ścieżki sprzężenia zwrotnego.

Cele: 1. Aby określić reakcję na dawkę DHA w celu zwiększenia EPA. 2. Zbadaj dawkę DHA i czas, w którym zwiększa się EPA, stosując CSIA. 3. Pomiar wskaźników obrotu i strat EPA, DPAn-3 i DHA. 4. Dostarczyć dane do analizy eksploracyjnej związanej z metabolizmem PUFA, spożyciem ALA i jego wpływem na poziomy EPA i DHA oraz wpływem DHA na biomarkery związane z chorobą, białko C-reaktywne (CRP) i krzepliwość krwi.

Projekt badania: Współgłówni badacze, dr. Richard Bazinet i dr John Sievenpiper oraz współbadacze, dr. David Jenkins i Adam Metherel wraz z doktorantką Amy Symington przeprowadzą podwójnie ślepą, kontrolowaną placebo próbę suplementacji w zależności od dawki. Siedemdziesięciu dwóch zdrowych wegan lub wegetarian w wieku 18–50 lat zostanie losowo przydzielonych do 1 z 6 grup. Przed randomizacją uczestnicy przejdą 2-tygodniową fazę przygotowawczą w celu zebrania danych z kwestionariusza. Po randomizacji każda grupa będzie przyjmowała suplementy DHA w dawce 0 mg (placebo), 100 mg, 200 mg, 400 mg, 800 mg i 1000 mg dziennie przez 8 tygodni. Dawki te reprezentują zakres poziomów spożycia DHA obejmujący średnie spożycie w populacji (<100 mg/d), często zalecane spożycie (250 - 500 mg/d) oraz poziomy spożycia DHA, o których wiadomo, że zwiększają poziom EPA w osoczu (1000 mg/d). Przeprowadzona zostanie ankieta w celu uzyskania informacji odnośnie przybliżonego spożycia ALA, EPA i DHA przed i po okresie suplementacji. Dostarczony zostanie 3-dniowy ważony dziennik diety, umożliwiający określenie spożycia pokarmu w trakcie okresu suplementacji i ocenę spożycia ALA. Uczestnicy zostaną poproszeni o powstrzymanie się od spożywania pokarmów bogatych w DHA w okresie suplementacji. Nie będzie to stanowić problemu, ponieważ ta populacja na ogół nie spożywa pokarmów bogatych w DHA. Wyjściowe spożycie niezbędnego kwasu tłuszczowego ALA zostanie ocenione za pomocą kwestionariusza i zweryfikowane na podstawie próbek krwi.

Uczestnicy: Do badania zostanie włączonych 72 zdrowych wegetarian i wegan, aby zapewnić możliwie najniższy wyjściowy poziom EPA i DHA. Kryteria wykluczenia są następujące: spożycie suplementu EPA i/lub DHA w ciągu ostatnich sześciu miesięcy, zawartość DHA w całkowitym lipidzie osocza wynosi 3% lub więcej, BMI <18 kg/m2 lub >30 kg/m2, jest w okresie menopauzy lub po - menopauza, ciąża lub karmienie piersią, choroby przewlekłe lub zakaźne (takie jak stwardnienie rozsiane, choroba nerek i jelit, cukrzyca typu 2, nowotwory lub choroby serca), stosowanie przewlekłych leków przeciwzapalnych, stosowanie leków kontrolujących stężenie lipidów, hipertriglicerydemia (> 4 mmol/l) lub hipercholesterolemia (LDL-C > 5 mmol/l), przewiduje się poważne zmiany w stylu życia, pali papierosy, nadużywa alkoholu (> 3 drinki dziennie) i przeprowadza poważną operację lub brał udział w badaniu interwencyjnym w ciągu ostatnich sześciu miesiące. Te dane dotyczące wykluczenia są zgodne z wcześniejszymi metaanalizami i badaniami dotyczącymi suplementacji n-3, w których stosowano powyższe kryteria wykluczenia, ponieważ wpływają one na metabolizm n-3 PUFA. Uczestnicy, którzy podpiszą formularz zgody, a którzy później zostaną uznani za niekwalifikujących się ze względu na BMI lub % poziomów DHA, zostaną poinformowani e-mailem i/lub telefonicznie. Zostało to wyjaśnione w formularzu zgody.

Analizy kwasów tłuszczowych: Próbki krwi na spotkania początkowe i kontrolne zostaną pobrane po 12-godzinnym poszczeniu przez noc. Próbki krwi będą pobierane w dniach 0, 3, 7, 14, 28 i 56. Próbki zostaną pobrane przez dyplomowaną pielęgniarkę. Próbki krwi pełnej od każdego uczestnika zostaną zapisane i przechowywane. Następnie pozostałe próbki krwi pełnej od każdego uczestnika zostaną odwirowane, a z każdej próbki wyizolowane zostanie osocze i czerwone krwinki (RBC). Będą przechowywane w temperaturze -80°C w szczelnym pojemniku do czasu konieczności analizy. Próbki osocza i czerwonych krwinek będą analizowane pod kątem stężeń kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej (GC) z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, a węgiel delta-13 (δ13C) będzie oceniany za pomocą spektrometrii masowej stosunku izotopów GC. Osocze i czerwone krwinki będą analizowane przy zastosowaniu zmian w poziomach EPA w osoczu jako wyniku głównego i sygnatury δ13C EPA w osoczu, mierzonej za pomocą analizy izotopów specyficznych dla związku (CSIA), jako wyniku drugorzędnego. Zmierzona zostanie również sygnatura δ13C EPA, aby sprawdzić, czy jest ona zgodna z sygnaturą δ13C ALA w osoczu, a nie suplementu DHA.

Wielkość próbki: Moc obliczono na podstawie wyników z literatury, która konsekwentnie podaje zmiany w stężeniu EPA w osoczu po suplementacji DHA przez 6 tygodni u 12 osób, co jest zgodne z naszymi ustaleniami. Korzystając ze średnich, odchyleń standardowych i wielkości próbek z badania Metherel i wsp. z 2019 r. oraz tych dwóch poprzednich badań, alfa = 0,05 i pożądanej mocy 0,8, określiliśmy wielkość próby wynoszącą nieco ponad 9 jako wystarczającą do uzyskania statystycznie istotnego efektu. W związku z tym, aby uwzględnić przewidywany wskaźnik rezygnacji na poziomie 20–25%, zrekrutujemy 12 uczestników, aby upewnić się, że mamy odpowiednią moc do osiągnięcia naszego głównego wyniku.

Analiza wtórna: W zależności od rekrutacji badacze sprawdzą, czy mężczyźni i kobiety reagują inaczej w analizie eksploracyjnej, uznając, że mogą nie być w stanie wykryć potencjalnie rzeczywistych, ale niewielkich różnic związanych z płcią. W ramach analizy cząstkowej badacze wykorzystają pobrane próbki krwi pełnej do określenia izoform FADS1, FADS2, ELOVL2 i ELOVL5, które, jak wykazano, wpływają na poziomy EPA i DHA we krwi.

Badacze dostarczą także dane do przeprowadzenia dodatkowej analizy dotyczącej obrotu i strat n-3 PUFA, spożycia ALA przez uczestników i jego wpływu na metabolizm n-3 PUFA. Ponadto określone zostaną niektóre korzystne skutki, które zgodnie z bieżącymi badaniami mogą wystąpić w przypadku suplementacji DHA, w tym ciśnienie krwi, tętno, trójglicerydy oraz LDL, HDL i cholesterol całkowity.

Rekrutacja: Uczestnicy będą rekrutowani za pośrednictwem poczty elektronicznej i mediów społecznościowych do różnych grup i organizacji skupiających się na wegetarianach/weganach.

Analizy antropometryczne: Wzrost będzie mierzony za pomocą stadiometru montowanego na ścianie.

Masę ciała ocenia się za pomocą skali belkowej. Obwód talii zostanie oceniony z wykorzystaniem metodyki Heart and Stroke Foundation. Zmierzone zostanie ciśnienie krwi (BP) i tętno spoczynkowe. Aby uzyskać ten pomiar, uczestnicy będą siedzieć w cichym pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze przez co najmniej 5 minut, aby osiągnąć tętno spoczynkowe i ciśnienie krwi. Następnie ciśnienie będzie mierzone oscylometrycznie przy użyciu OMRON Intellisense HEM-907 zgodnie z kryteriami JNC VII. Ciśnienie będzie mierzone trzykrotnie, przy czym każdy pomiar będzie oddalony o jedną minutę, po czym zostanie pobrana średnia z trzech pomiarów.

Analizy biochemiczne: Próbki osocza i czerwonych krwinek na obecność EPA i DHA zostaną oddzielone w wirówce i natychmiast zamrożone w temperaturze -80°C na Uniwersytecie w Toronto do późniejszej analizy. Chociaż głównym celem wyniku jest osocze, zarówno próbki osocza, jak i krwinek czerwonych będą analizowane w celach porównawczych przy użyciu GC-FID w celu określenia poziomów EPA i DHA, a δ13C będzie analizowane przy użyciu GC-IRMS.

Kwestionariusz wyjściowy i uzupełniający: Aby uzyskać przybliżone spożycie ALA, EPA i DHA zarówno przed, jak i po okresie suplementacji, uczestnicy otrzymają e-mailem kwestionariusz do wypełnienia po pierwszym spotkaniu telefonicznym/na zoomie oraz podczas ostatniej wizyty w dniu 56.

Analiza statystyczna

Wyniki pierwotne. Próbki osocza i czerwonych krwinek (RBC) będą analizowane przy użyciu GC-FID w celu określenia stężenia n-3 PUFA w każdej grupie. Analiza statystyczna zostanie przeprowadzona za pomocą dwuczynnikowej analizy ANOVA (dawka x czas) z powtarzanymi pomiarami w odpowiednim czasie w celu określenia interakcji i/lub głównych efektów. Ponadto wzrost poziomów EPA będzie analizowany za pomocą regresji segmentowej (lub analizy punktu granicznego), tak jak ma to miejsce w przypadku techniki utleniania aminokwasów wskaźnikowych pomiędzy dawkami i w każdym punkcie czasowym w celu określenia dawki suplementacji DHA, która powoduje nagły wzrost w poziomach EPA – dawka DHA, która inicjuje hamowanie przez sprzężenie zwrotne. Powtarzane pomiary post hoc Test Tukeya zostaną wykorzystane do określenia znaczących różnic w% DHA i EPA% pomiędzy wizytami, jak również pomiędzy grupami. Test Gamesa-Howella zostanie przeprowadzony podczas testu Tukeya, jeśli w grupie będzie nierówna liczba uczestników z powodu rezygnacji.

Wyniki wtórne. δ13C będzie analizowane przy użyciu GC-IRMS. Zmierzona zostanie sygnatura δ13C EPA, aby sprawdzić, czy jest ona zgodna z sygnaturą δ13C ALA w osoczu, a nie suplementu DHA. Wskaźniki obrotu i okresy półtrwania EPA, DPAn-3 i DHA zostaną obliczone za pomocą programu GraphPad Prism w wersji 10.0, a tempo utraty EPA, DPAn-3 i DHA z osocza w nmol/ml/dzień zostanie obliczone przy użyciu następującego wzoru: wzór: Jout = 0,693CFA/t1/2.

Wyniki eksploracji i przestrzegania zaleceń. Modele efektu mieszanego z powtarzanymi pomiarami zostaną wykorzystane do oceny zmian we wszystkich wynikach eksploracji bez kontrolowania współczynnika fałszywych odkryć. Porównania parami pomiędzy grupami zostaną przeprowadzone przy użyciu korekty Tukeya-Kramera lub innych odpowiednich statystyk. Zbadana zostanie modyfikacja efektu poprzez spożycie ALA, płeć i genetykę, a próbki krwi zostaną przeanalizowane pod kątem zgodności.

Analiza podgrup. Analiza aprioryczna zostanie przeprowadzona według wieku, płci, pochodzenia etnicznego, wyjściowego BMI, wyjściowego obwodu talii, wariantów genetycznych i spożycia ALA.