Uma investigação de resposta à dose de ácido docosahexaenóico (DHA) (DRI-DHA)

O ácido docosahexaenóico (DHA) é vital para a estrutura das membranas celulares, essencial para o desenvolvimento do cérebro e dos olhos, encontrado em níveis elevados em todo o cérebro e sistema nervoso e é importante para o desenvolvimento cognitivo ideal em crianças, o crescimento do feto durante a gravidez e a saúde. leite materno durante a lactação. O DHA também demonstrou ajudar na proteção contra sintomas primários e secundários de doenças cardiovasculares, bem como degeneração macular. No entanto, se o DHA é considerado essencial na dieta permanece controverso. Enquanto isso, o Instituto de Medicina (agora Academia Nacional de Medicina) estabeleceu uma ingestão adequada do precursor do DHA, o ácido alfa-linolênico (ALA), em 1,6 g/d e 1,1 g/d para homens e mulheres saudáveis, respectivamente. Os investigadores acreditam que a confusão surge da abordagem ao estudo dos ácidos gordos ómega-3, particularmente das necessidades de DHA. Para estes estudos, o DHA é suplementado e, muitas vezes, resultados de doenças multifatoriais e complexos são usados ​​como desfechos. As doses de DHA utilizadas nestes estudos são frequentemente subjetivas e os participantes, incluindo os controlos, têm ingestões e níveis variados de DHA. Seria útil suplementar uma população, como vegetarianos ou veganos, cujos níveis são igualmente baixos. Classicamente, acreditava-se que quando o DHA é consumido, uma porção é convertida “regressivamente” em ácido eicosapentaenóico (EPA), que então se acumula em um processo denominado “retroconversão”. No entanto, utilizando uma nova abordagem chamada análise de isótopos específicos de compostos (CSIA), os investigadores observaram que o aumento do EPA não se deve principalmente à retroconversão, mas sim a um acúmulo de EPA originado principalmente do ALA. Demonstrado inicialmente em modelos de roedores pelo CSIA, a equipe confirmou por modelagem semelhante que o consumo de DHA em humanos resulta no mesmo acúmulo de EPA. Criticamente, o DHA induz um atraso no metabolismo do EPA e o ALA dietético parece ser essencial para esse atraso. Assim, o aumento de EPA representa uma via de feedback bioquímico que retarda a síntese de DHA em resposta a DHA suficiente.

Significância: Ao determinar com precisão a menor quantidade de DHA necessária para ativar este mecanismo de feedback, pode ser útil para estimativas futuras das necessidades de DHA. Além disso, o problema com as quantidades sugeridas para as recomendações não oficiais é que se a população mundial consumisse estas quantidades, seria ambientalmente preocupante, uma vez que este nutriente é ecologicamente sensível, sendo a sua principal fonte proveniente de unidades populacionais de peixes oceânicos já sob pressão, encorajando práticas de pesca insustentáveis. , algo que ambientalistas e investigadores dizem estar a criar preocupações legítimas em matéria de clima e saúde.

Hipótese: A dose na qual o EPA aumenta com o aumento do DHA é o ponto em que o alongamento diminui, indicando que uma via de feedback significativa está presente.

Objetivos: 1. Para determinar a dose-resposta do DHA para aumentar o EPA. 2. Investigue a dose e o tempo de DHA que aumenta o EPA usando CSIA. 3. Medir as taxas de rotatividade e perdas de EPA, DPAn-3 e DHA. 4. Fornecer dados para análise exploratória relacionados ao metabolismo de PUFA, consumo de ALA e seu efeito nos níveis de EPA e DHA, e efeitos do DHA em biomarcadores relacionados a doenças, proteína C reativa (PCR) e coagulação sanguínea.

Desenho do ensaio: Os co-investigadores principais Dr. Richard Bazinet e Dr. John Sievenpiper e co-investigadores, Drs. David Jenkins e Adam Metherel, juntamente com a estudante de doutorado Amy Symington, conduzirão um ensaio duplo-cego, controlado por placebo, de suplementação dose-resposta. Setenta e dois veganos ou vegetarianos saudáveis ​​com idade entre 18 e 50 anos serão distribuídos aleatoriamente em 1 de 6 grupos. Antes da randomização, os participantes passarão por uma fase inicial de 2 semanas para coletar os dados do questionário. Uma vez randomizado, cada grupo tomará suplementos de DHA de 0 mg (placebo), 100 mg, 200 mg, 400 mg, 800 mg e 1000 mg por dia ao longo de 8 semanas. Essas doses representam a faixa de níveis de ingestão de DHA abrangendo a ingestão média da população (<100 mg/d), ingestões frequentemente recomendadas (250 - 500 mg/d) e níveis de ingestão de DHA conhecidos por aumentar os níveis plasmáticos de EPA (1000 mg/d). Um questionário será aplicado para obter informações em relação à ingestão aproximada de ALA, EPA e DHA antes e após o período de suplementação. Um diário alimentar pesado de 3 dias será fornecido para obter a ingestão de alimentos ao longo do período de suplementação para avaliar o consumo de ALA. Os participantes serão solicitados a abster-se de alimentos ricos em DHA durante o período de suplementação. Isto não será um problema, uma vez que esta população geralmente não consome alimentos ricos em DHA. A ingestão inicial do ácido graxo essencial ALA será avaliada por meio de questionário e verificada por amostras de sangue.

Participantes: O estudo recrutará 72 vegetarianos e veganos saudáveis ​​para permitir os níveis iniciais mais baixos possíveis de EPA e DHA. Os critérios de exclusão são os seguintes: consumo de suplemento de EPA e/ou DHA nos últimos seis meses, ter 3% ou mais de DHA em seus lipídios plasmáticos totais, IMC <18 kg/m2 ou >30 kg/m2, estar na menopausa ou pós-menopausa. -menopausa, gravidez ou amamentação, doenças crônicas ou transmissíveis (como esclerose múltipla, doença renal e inflamatória intestinal, diabetes tipo 2, câncer ou doença cardíaca), uso de medicamentos antiinflamatórios crônicos, uso de medicamentos para controle de lipídios, hipertrigliceridemia (> 4 mmol/l) ou hipercolesterolemia (LDL-C >5 mmol/l), prevê grandes mudanças no estilo de vida, fumante, usuário pesado de álcool (>3 bebidas/dia) e cirurgia de grande porte ou participou de um estudo de intervenção nos últimos seis meses. Esses dados de exclusão estão de acordo com meta-análises anteriores e ensaios de suplementação com n-3 que usaram os critérios de exclusão acima, pois afetam o metabolismo dos PUFA n-3. Os participantes que assinarem o termo de consentimento e posteriormente considerados inelegíveis devido ao IMC ou% dos níveis de DHA serão informados por e-mail e/ou telefone. Isso é explicado no formulário de consentimento.

Análises de ácidos graxos: Amostras de sangue para consultas iniciais e de acompanhamento serão obtidas após um jejum noturno de 12 horas. Amostras de sangue serão coletadas nos dias 0, 3, 7, 14, 28 e 56. As amostras serão coletadas por uma enfermeira registrada. Amostras de sangue total serão salvas e armazenadas de cada participante. Em seguida, as amostras de sangue total restantes de cada participante serão centrifugadas e o plasma e os glóbulos vermelhos (RBCs) isolados de cada amostra. Eles serão armazenados a -80°C em um recipiente hermético até serem necessários para análise. Amostras de plasma e hemácias serão analisadas quanto às concentrações de ácidos graxos usando cromatografia gasosa (GC) - detecção de ionização de chama e delta carbono-13 (δ13C) será avaliado usando espectrometria de massa de proporção de isótopos GC. Plasma e hemácias serão analisados ​​​​com alterações nos níveis plasmáticos de EPA como resultado primário e assinatura plasmática δ13C EPA, medida por análise de isótopos específicos do composto (CSIA), como resultado secundário. A assinatura δ13C do EPA também será medida para verificar se ela se alinha com a assinatura δ13C do ALA plasmático e não com o suplemento de DHA.

Tamanho da amostra: O poder foi calculado com base nos resultados da literatura que relatou consistentemente alterações no EPA plasmático após a suplementação de DHA por 6 semanas com 12 indivíduos, e é consistente com nossos achados. Usando médias, desvios padrão e tamanhos de amostra do estudo de Metherel et al em 2019 e desses dois estudos anteriores, um alfa = 0,05 e poder desejado de 0,8, determinamos tamanhos de amostra de pouco mais de 9 como suficientes para produzir um efeito estatisticamente significativo. Como tal, para contabilizar uma taxa de abandono projetada de 20-25%, recrutaremos 12 participantes para garantir que tenhamos a capacidade adequada para o nosso resultado primário.

Análise secundária: Dependendo do recrutamento, os investigadores examinarão se homens e mulheres respondem de forma diferente em uma análise exploratória, reconhecendo que eles podem não ter o poder de detectar diferenças potencialmente reais, mas pequenas, relacionadas ao sexo. Os investigadores usarão amostras de sangue total coletadas para determinar as isoformas FADS1, FADS2, ELOVL2 e ELOVL5 que demonstraram afetar os níveis sanguíneos de EPA e DHA como uma subanálise.

Os investigadores também fornecerão dados para fazer análises adicionais relacionadas à rotatividade e perda de PUFA n-3, consumo de ALA dos participantes e seu efeito no metabolismo de PUFA n-3. Além disso, serão determinados alguns dos resultados benéficos que podem ocorrer com a suplementação de DHA, de acordo com a pesquisa atual, incluindo pressão arterial, frequência cardíaca, triglicerídeos e LDL, HDL e colesterol total.

Recrutamento: Os participantes serão recrutados por e-mail e mídia social para vários grupos e organizações com foco vegetariano/vegano.

Análises antropométricas: A altura será medida com um estadiômetro montado na parede.

O peso corporal será avaliado por balança de viga. A circunferência da cintura será avaliada usando a metodologia Heart and Stroke Foundation. A pressão arterial (PA) e a frequência cardíaca em repouso serão medidas. Para coletar esta medida, os participantes permanecerão sentados em uma sala silenciosa e com temperatura controlada por pelo menos 5 minutos para atingir a frequência cardíaca e a PA em repouso. Posteriormente, a PA será medida oscilometricamente usando o OMRON Intellisense HEM-907 de acordo com os critérios JNC VII. A PA será aferida em triplicata, com cada medida separada por um minuto, e será feita a média das três medidas.

Análises bioquímicas: Amostras de plasma e hemácias para EPA e DHA serão separadas por centrífuga e imediatamente congeladas a -80 C na Universidade de Toronto para análise posterior. Embora o plasma seja o foco principal para o resultado, tanto as amostras de plasma quanto de hemácias serão analisadas para comparação usando GC-FID para determinar os níveis de EPA e DHA e δ13C serão analisados ​​usando GC-IRMS.

Questionário de linha de base e acompanhamento: Para obter a ingestão aproximada de ALA, EPA e DHA antes e depois do período de suplementação, um questionário será fornecido aos participantes por e-mail para preenchimento após a primeira reunião por telefone/zoom e na visita final no dia 56.

Análise Estatística

Resultados primários. Amostras de plasma e glóbulos vermelhos (RBC) serão analisadas usando GC-FID para determinar as concentrações de PUFA n-3 dentro de cada grupo. A análise estatística será realizada por meio de ANOVA bidirecional (dose x tempo) com medidas repetidas no tempo para determinar interação e/ou efeitos principais. Além disso, o aumento nos níveis de EPA será analisado por regressão segmentada (ou análise de breakpoint), como é feito com a técnica de oxidação de aminoácidos indicadores entre doses e dentro de cada ponto de tempo para identificar a dose de suplementação de DHA que resulta em um aumento repentino nos níveis de EPA, a dose de DHA que inicia a inibição por feedback. Medidas repetidas post hoc, teste de Tukey serão usadas para determinar diferenças significativas em DHA% e EPA% entre visitas, bem como entre grupos. Um teste de Games-Howell seria administrado durante o teste de Tukey se um grupo tivesse números desiguais de participantes devido a desistências.

Resultados secundários. δ13C será analisado usando GC-IRMS. A assinatura δ13C do EPA será medida para verificar se ela se alinha com a assinatura δ13C do ALA plasmático e não com o suplemento de DHA. As taxas de rotatividade e meias-vidas de EPA, DPAn-3 e DHA serão calculadas pelo GraphPad Prism versão 10.0 e a taxa de perda de EPA, DPAn-3 e DHA em nmol/ml/dia do plasma será calculada usando o seguinte fórmula: Jout = 0,693CFA/t1/2.

Resultados exploratórios e de adesão. Modelos de efeitos mistos de medidas repetidas serão usados ​​para avaliar mudanças em todos os resultados exploratórios sem controlar a taxa de falsas descobertas. Comparações pareadas entre grupos serão realizadas usando ajuste de Tukey-Kramer ou outras estatísticas apropriadas. A modificação do efeito pelo consumo de ALA, sexo e genética será explorada e amostras de sangue serão analisadas para conformidade.

Análise de subgrupo. A análise a priori será realizada por idade, sexo, etnia, IMC basal, circunferência da cintura basal, variantes genéticas e consumo de ALA.