Isolamento del DNA fetale libero da cellule dal mezzo di coltura esaurito e suo potenziale ruolo per la diagnosi genetica preimpianto (PGD).

La non invasività è un tema comune in tutte le specialità mediche del 21° secolo. In ostetricia, i test prenatali non invasivi hanno provocato un cambiamento di paradigma nella pratica clinica prenatale attraverso il sequenziamento del DNA libero da cellule fetali (cfDNA) nel plasma materno. Tuttavia, la pratica attuale per i test genetici preimpianto per l’aneuploidia (PGT-A) richiede la biopsia del trofettoderma, che comporta sfide tecniche e problemi di vitalità dell’embrione. La possibilità di superare questi problemi è apparsa all'orizzonte negli ultimi anni, con la scoperta che il cfDNA rilasciato dall'embrione nei terreni di coltura durante le ultime fasi di sviluppo offre una nuova strategia per valutare geneticamente l'embrione preimpianto.

Il nostro studio valuta la possibilità di isolare il DNA libero da cellule fetali (cfDNA) dai terreni di coltura e confrontare i risultati con campioni di biopsia TE degli stessi pazienti sottoposti a un ciclo di stimolazione IVF con iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi presso l'ospedale Al-Sharq tra marzo 2022 e aprile 2023. Durante il periodo dello studio, tutti gli embrioni sono stati coltivati ​​fino allo stadio di blastocisti. Tutti i pazienti arruolati sono stati sottoposti a niPGD per la determinazione del genere utilizzando terreni di coltura esauriti, nonché a PGD standard con biopsia TE utilizzando la tecnica di reazione a catena della polimerasi per il gene SRY. Gli embrioni sono stati coltivati ​​individualmente in goccioline di terreno da 30 ml e lo sviluppo dell'embrione è progredito utilizzando terreni di coltura sequenziali, in linea con la pratica di laboratorio di routine. Per l'analisi niPGD, i terreni di coltura allo stadio di blastocisti al giorno 5 sono stati raccolti (10-20 µl) immediatamente prima che fosse eseguita la biopsia TE. Solo gli embrioni che hanno raggiunto un grado 1 (frammentazione inferiore al 15%) sono stati considerati idonei alla biopsia e alla vitrificazione. I campioni dei terreni di coltura embrionali sono stati sottoposti ad amplificazione dell'intero genoma (WGA) utilizzando il kit DOPlify® WGA (PerkinElmer) per generare un'amplificazione rappresentativa del DNA totale dai terreni di coltura esauriti. Il WGA basato su DOP-PCR amplifica in modo riproducibile il DNA totale per produrre quantità di microgrammi di DNA genomico amplificato e purificato in meno di 3 ore. Il nostro obiettivo è valutare i tassi di concordanza tra i risultati della biopsia del trofettoderma e il cfDNA raccolto dai terreni esauriti con un protocollo ottimizzato per ottenere una quantità e una qualità adeguate di DNA genomico. Questo interessante lavoro rappresenta uno sforzo importante per stabilire la fattibilità del nuovo approccio non invasivo che può essere un'alternativa affidabile per la valutazione delle anomalie cromosomiche degli embrioni coltivati ​​in vitro che porteranno alla nascita di un bambino vivo e sano.

Successivamente, eseguiremo il rilevamento del gene SRY per la determinazione del sesso utilizzando la reazione a catena della polimerasi sul DNA fetale privo di cellule isolato da campioni di terreni esauriti e confronteremo i nostri risultati con i risultati della TB.