肥満および 2 型糖尿病におけるグルコースおよび脂質代謝に対するインスリンおよび運動の効果の異常

背景 インスリン抵抗性 (IR) は、肥満および 2 型糖尿病 (T2D) における心血管疾患 (CVD) のリスク増加に大きな役割を果たしています。 しかし、影響を受けた組織における IR の標的治療は、減量と身体活動を除いてほとんど存在しません。 この提案の中心的な仮説は、グルコースと脂質代謝の異常、およびインスリンと運動によって調節される分子プロセスの欠陥が、肥満と T2D の骨格筋で観察される IR、ミトコンドリア機能障害、脂質蓄積の間の関連性を説明できるということです。 これらの代謝異常と分子異常に焦点を当てた私たちのプロジェクトの主な目標は、T2D と CVD の予防と治療に使用できる、IR の治療と運動を模倣するための新しい標的を発見することです。

T2D、肥満、およびその他の高リスク状態は、インスリンを介したグルコース処理の主要部位である骨格筋の IR によって特徴付けられます (1-3)。 2 型糖尿病では、膵臓の β 細胞がこの異常を補うことができず、高血糖を引き起こし、心血管疾患のリスクをさらに悪化させます。 広範な研究にもかかわらず、IR の根底にある正確な代謝および分子メカニズムは完全には理解されていません。 代謝レベルでは、研究者らは、肥満および T2D における IR が、インスリン刺激性のグルコース取り込みおよびグルコース貯蔵の障害によって特徴付けられることを実証しましたが、インスリンを介したグルコース酸化の増加を減少させ、脂質酸化および循環レベルの抑制を弱めることも示しました。インスリンに応答した遊離脂肪酸 (脂肪分解) (2,3)。 分子レベルでは、これらの代謝異常は、IRS-1、PI3K、Akt、AS160、および RAC1 を介したグルコース輸送へのインスリン シグナル伝達の減少と、骨格筋のグリコーゲン合成酵素に対するインスリン作用の障害によるグリコーゲン合成に関連しています (1-10)。 さらに、IR は、2 型糖尿病患者、肥満および高リスクの個人の骨格筋における脂質含有量の蓄積およびミトコンドリア機能障害のさまざまな尺度と一貫して関連しています (1-3、11、12)。

さらに、解糖の増加 (13-15) と、T2D および肥満における運動の有益な効果に対する耐性 (16-18) の証拠が蓄積されています。 IR条件での基質代謝の変化は、分枝鎖アミノ酸とα-ヒドロキシ酪酸の循環レベルの増加、およびグリシンのレベルの低下を含む特定のメタボロームサインと関連しているようです(19-23)。 最後に、T2D、肥満およびその他の高リスク状態における脂肪組織の拡張性の障害は、炎症性因子の分泌の増加と遊離脂肪酸のオーバーフローを引き起こし、肝臓と筋肉に異所性脂質沈着を引き起こすことにより、IR および T2D の病因に関与している可能性があります ( 24）。 大規模な GWAS 研究で T2D、肥満、および体組成に関連することが判明した遺伝子変異体は、脂肪組織の拡大と炎症におけるいくつかの転写因子とシグナル伝達経路の役割を示唆しています (25,26)。

運動の効果: 身体活動は、T2D の予防と治療において基本的な役割を果たします (27-29)。 したがって、いくつかの長期 (> 8 週間) 運動トレーニング研究のメタアナリシスは、運動が T2D 患者の体組成、インスリン感受性を改善し、Hb1Ac を約 0.67% 減少させることができることを示しています (30)。 中程度の強度の片足運動を 1 回行うことの有益な効果には、筋肉へのブドウ糖の取り込みが即座に増加することが含まれます (31)。 これに続いて、より長い (

運動モード: IR 個人に最適な運動モードはまだ確立されていません。 この点での主要な問題は、健康への継続的な有益な効果だけでなく、継続的な関与 (患者の遵守) を確実にする効果的な運動モード (種類、強度、および期間) を見つけることです (29)。 したがって、IR 個人にとって、エネルギー消費を安全かつ効果的に最大化できる運動モードを特定することが重要です。 これは、サイクリングやローイングなどの非体重運動モードである可能性があります. これまでのほとんどの研究では、ステーショナリー バイクに対する急性運動または持久力運動トレーニングの効果が報告されています。 しかし、ローイング中のエネルギー消費と脂肪の酸化は、サイクリング中よりも高いことが示されています (39,40)。 IR、脂質の蓄積、および筋肉のミトコンドリア機能不全の間の強い関連性により、脂肪燃焼運動は特に興味深いものになります (29,40)。 エネルギー消費に対する脂肪の酸化の寄与は、低強度および中強度の運動中 (VO2max の 45 ～ 65 %) で最も高くなります (41-43)。 したがって、適度な強度でのサイクリングとローイングの組み合わせは、体重を支えないという性質と、下半身と上半身の両方の筋肉群の関与により、魅力的な運動モードになる可能性があります (29)。 私たちの研究では、インスリン感受性、体組成、心肺機能、膵臓ベータ細​​胞機能、およびグルコースの代謝および分子調節因子に対するエルゴメーターでのサイクリングとローイングを組み合わせた高強度インターバルトレーニングプロトコルの効果と忍容性を初めて評価します。肥満およびT2D対体重が一致したコントロールにおける取り込みとエネルギー代謝。

運動抵抗: 運動トレーニングは T2D 予防に不可欠な側面です (27,28)。 激しい運動と持久力トレーニングは、肥満や T2D においてもインスリン感受性を改善します (34)。 運動はさまざまなシグナル伝達経路を活性化し、ミトコンドリアの生合成、グルコースと脂肪酸の代謝、および筋肉のリモデリングを調節する転写ネットワークのアップレギュレーションをもたらします (44)。 これには、筋肉特異的マイクロRNA（miRNA）レベルの増加、NR4Asサブファミリー、PPARファミリー、その他の転写因子などの核内受容体の活性化が含まれます（45-50）。 これは、ミトコンドリア生合成を促進することにより、酸化的リン酸化と脂肪酸酸化を促進する PGC-1α の運動誘発性刺激と一緒に起こります (51)。 これは、AMPK、p38 MAPK、CamK-II、CREB、およびその他の上流調節因子の活性化によって媒介されるようです (51-53)。 さらに、運動は、Akt、AMPK、TBC1D4、RAC1 などのグルコース輸送への運動およびインスリン媒介シグナル伝達の両方に関与するタンパク質の活性および/またはレベルを増加させます (8、10、34、35、54、55)。 過去 10 年間に、さまざまな IR 条件で運動に対する反応が損なわれることが多くの報告で示されています。 したがって、早発性 2 型糖尿病および肥満や 2 型糖尿病患者の第一度近親者などの糖尿病前症の状態では、激しい運動または運動トレーニングに反応した VO2max およびインスリン感受性の増加の欠如が報告されています (16-18,56、 57)。 分子レベルでは、これらの異常は、PGC-1αおよびミトコンドリアの生合成とダイナミクスの他の調節因子の増加障害と関連していました (16-18,56,57)。 これは、T2D およびその他の一般的な IR 条件における「運動抵抗」の存在を示唆しています。 しかし、急性運動がヒト筋肉のインスリン感受性とVO2 maxに及ぼすこれらの影響の根底にある転写ネットワークとシグナル伝達ネットワーク、および肥満とT2Dの代謝および分子変化の可能性はまだ確立されていません。 さらに、これらの研究のほとんどで不適切な研究デザインが行われているため、これらの調査結果が過体重/肥満自体にどの程度関連しているかは不明です. 急性運動と運動トレーニングによって調節される転写ネットワークとシグナル伝達ネットワークをよりよく理解することは、2型糖尿病を予防するためにIR個人のライフスタイル介入を設計するために重要です。

ミトコンドリアのダイナミクスとマイトファジー: 2 型糖尿病、肥満、その他の高リスク状態における IR とミトコンドリアの機能障害との関連性が多数の研究で示唆されています (1,11,12)。 これは、ミトコンドリア生合成の障害、ならびに筋肉ミトコンドリアの含有量の減少、内因性障害および形態学的変化の両方に関与しているようです (58-66)。 ミトコンドリアの機能障害は、IR 条件での脂質供給の増加とともに脂質の蓄積を引き起こし、インスリンシグナル伝達の負の変調を引き起こすことによって IR をさらに悪化させると考えられています (1,11)。 IR がミトコンドリア機能障害の原因または結果であるかどうかは議論されています。 最近、研究者などは、遺伝した IR がミトコンドリア含有量の減少のさまざまなマーカーをもたらすことを実証しました (67,68)。 これは、インスリンがmRNAレベルとミトコンドリアタンパク質の豊富さ、およびヒト骨格筋のATPフラックスを増加させることを示すデータによって裏付けられています(69-71)。 興味深いことに、最近のデータは、インスリンがミトコンドリアのダイナミクスを支配する分裂 (DRP1、FIS1) および融合 (MFN1/2、OPA1) タンパク質、ならびに LC3B、Mul1、および BNIP3/ などの損傷したミトコンドリアの除去 (マイトファジー) に関与する酵素を調節することを示しています。 3L および AMPK および mTOR を介した ULK1 のリン酸化 (72-76)。 最近の研究では、ミトコンドリア分裂因子 (MFF) が運動に反応した AMPK の直接的な基質であることが示され、AMPK の活性化が MMF と DRP1 の刺激によってミトコンドリア分裂を促進することが実証されました (77)。 したがって、ミトコンドリアのダイナミクスとミトファジーのインスリンおよび運動を介した調節の欠陥は、IRのミトコンドリア機能不全に寄与する可能性があります。 2型糖尿病患者および肥満のリスクの高い個人の骨格筋および/または脂肪にそのような異常がどの程度存在するかは、まだ調査されていません。

脂質の蓄積: 骨格筋における脂質の蓄積は、IR および T2D の発症と強く関連しています (2,78)。 脂肪酸は、脂肪滴 (LD) として知られるオルガネラにトリグリセリドとして保存されます。 トリグリセリド生合成には、GPAT、AGPAT、リピン、および DGAT のいくつかのアイソフォームが関与します (79)。運動に応じて、ATGL、CGI-58、および HSL が関与しているようです (80)。 複数のタンパク質が LD の表面に結合して、膜輸送、脂質代謝回転、LD の融合と形成、およびミトコンドリアを含む他のオルガネラとの相互作用を調節します (78,81,82)。 これには、SNARE タンパク質、STX5、SNAP23、VAMP4、および PLIN2、PLIN3、PLIN5 (以前は ADRP、TIP47、OXPAT として知られていた) などの LD コーティングタンパク質 (ペリリピン) が含まれます。 運動が人間の骨格筋におけるLDとミトコンドリア間の物理的相互作用を増加させ(83)、ミトコンドリアとの相互作用には、PLIN5、PLIN3、SNAP23などの特定のLD関連タンパク質が関与しているという証拠があります(84-86)。 トリグリセリド生合成、運動媒介性脂肪分解、LD 形成、およびミトコンドリアとの相互作用に関与する複数のタンパク質が、2 型糖尿病患者および肥満の高リスク患者のヒト骨格筋においてインスリンおよび運動によってどのように調節されるかは、これまで詳細に調査されていません。 インビボでのヒト骨格筋におけるこれらのメカニズムの研究は、脂質蓄積、ミトコンドリア機能不全、およびIRにおけるインスリンシグナル伝達の障害との関係を評価するために保証されています。

主要な代謝経路における酵素のリン酸化とリジンのアセチル化: ミトコンドリアの機能不全と脂質の蓄積に加えて、研究者と他の人々は、肥満と T2D における骨格筋の解糖の増強の証拠を提供しました (13-15)。 いくつかのプロテオーム研究で、研究者はヒトの筋肉と単離されたミトコンドリアのプロテオームとホスホプロテオームをマッピングしました (97-100)。他のグループからの報告とともに、これらの研究は、解糖、脂肪酸代謝、クレブス回路、および OxPhos に関与する酵素を示しました。は非常に豊富であり、筋肉のリン酸化とリジンのアセチル化の両方によって高度に修飾されています (89-92)。 さらに、研究者らは、インスリンがヒト骨格筋のミトコンドリアタンパク質のリン酸化を調節することを示しました(93)。 これには、クリステの形態とミトコンドリア呼吸にとって重要な、新たに定義されたミトコンドリア内膜組織化システム (MINOS) のコンポーネントが含まれていました。 さらに、ミトコンドリアタンパク質のリジンアセチル化はインスリン感受性と相関することが最近示されましたが、ADP/ATP トランスロカーゼ 1 (ANT1) のアセチル化は運動に反応して減少しました (94)。 特に興味深いことに、最近の研究では、症例の 50% でリジンのアセチル化がクロストークを示唆する同じペプチドのリン酸化と相互作用し、このメカニズムによって AMPK、AKT、PKA などのキナーゼの活性が調節されていることが示されました (92)。 この相互作用をよりよく理解することは、主要な代謝およびシグナル伝達経路における酵素の翻訳後調節を理解するために不可欠です。 異常なリジン アセチル化には、細胞質およびミトコンドリアのデアセチラーゼ、Sirt1 および Sirt3 が関与している可能性があります。 AMPK、PGC-1alpha、および複数のミトコンドリアタンパク質、ならびにインスリンシグナル伝達およびその他の分子経路における重要な酵素 (95)。 IRの有無にかかわらず、リジンのアセチル化とリン酸化、およびインスリンと運動によるそれらの相互作用の調節の可能性はこれまで調査されておらず、IR、解糖の強化、インスリンシグナル伝達の障害、ミトコンドリア機能障害、脂質蓄積に関連する重要な情報を提供する可能性があります。

脂肪組織の拡張性: 最近の GWAS メタ分析では、BMI とは関係なく、体脂肪分布 (ウエスト、ヒップ、WHR) の尺度に関連する複数の遺伝子座が特定されています (25,26)。脂肪細胞の発達または機能だけでなく、分布の違いに影響を与えるプロセスとしての脂肪生成、血管新生、転写調節、およびインスリン抵抗性。 脂肪組織の分布は、個人に固有のように見え、遺伝的変異などの遺伝的要因に依存する可能性があります。 体組成分析により、過食による皮下脂肪 (SAT) と異所性脂肪 (内臓、肝臓、筋肉) の相対的な拡大が決定されました。 このような研究は、脂肪組織の拡張性仮説に貢献しており、SAT の拡張能力は有限であり、その能力を超えると異所性トリグリセリド沈着が起こる (24)。 SAT の拡張性の可能性は、過食に対する有害な代謝反応からの保護/素因となります。 個人的な脂肪閾値の概念は、自分自身の閾値を超えると、異所性貯蔵所の拡大/代謝の代償不全を伴う SAT 容量の大きな個人間変動を示唆しています。 2 型糖尿病患者および前糖尿病患者の脂肪組織の拡張性の障害に関与する潜在的な分子経路およびシグナル伝達経路は、まだ確立されていません。 さらに、運動が特定の分子メカニズムを通じて脂肪組織の拡張性を調節する可能性があるかどうかは不明です。

メタボロミクス: 過去 10 年間に、多くの代謝物がインスリン抵抗性と耐糖能障害の潜在的な代謝バイオマーカーとして提案されてきました (19-21)。 特に、脂肪分解、ケトジェネシス、タンパク質分解、グルコース代謝など、インスリンの影響を受ける経路に関連する代謝産物の循環レベルの変化が示唆されています (21)。 非糖尿病患者の代謝プロファイリング研究では、リン脂質、トリグリセリド、ヘキソース、α-ヒドロキシ酪酸、グリシン、グルタミン、分岐鎖および芳香族アミノ酸のレベルの変化が、インスリン抵抗性、耐糖能障害、および 2 型糖尿病の発症の初期のバイオマーカーとして報告されています。 (19-23)。 しかし、急性運動と運動トレーニングが代謝物を肥満とT2Dの正常な代謝サインにどの程度変化させるかはまだ決定されていません.

全体的な仮説と目的 上で概説したように、研究者らは、IR と、ミトコンドリア機能不全およびヒト骨格筋における脂質蓄積との関連性には、インスリンおよび運動を介した筋肉の調節の異常が関与しているという仮説を立てています。

1. インスリン感受性とエネルギー代謝、
2. インスリンシグナル伝達、
3. ミトコンドリアダイナミクスとマイトファジー、
4. 脂肪滴の機能とミトコンドリアとの相互作用、
5. 主要な代謝およびシグナル伝達経路における酵素のアセチル化およびリン酸化、ならびに
6. ミトコンドリアの生合成と基質代謝を調節する転写およびシグナル伝達ネットワーク。

さらに、研究者らは、これらの異常の少なくともいくつかは、特定の転写因子またはシグナル伝達経路の調節障害による脂肪組織の拡張性の障害に関連していると仮定しています。 最後に、これらの異常は、T2D および CVD の発生を検出および防止するために使用できるメタボローム シグネチャをもたらします。

この提案では、研究者は一連の研究を計画しています。そこでは、最先端の代謝特性評価と新しい運動トレーニング介入を、血液サンプル、骨格筋、脂肪生検の詳細な調査と組み合わせて、欠陥を特定することを目的としています。上記の新しい調節システムで、インスリンシグナル伝達、グルコースと脂質の代謝、および肥満とT2Dにおけるミトコンドリア機能の既知の異常との潜在的な関係を調べます。 私たちの研究パートナーとの緊密な協力により、培養筋管および脂肪細胞、ならびにマウスモデルにおけるそのような欠陥のさらなる特徴付けによって、さらなる機構的洞察が得られます。 研究者は最終的に、これが現在 T2D と CVD の治療と予防に欠けている IR の治療と運動を模倣するための新しい標的を特定するのに役立つことを期待しています。

具体的な仮説

対応する対照群と比較して、研究者らは、肥満および T2D 患者は、絶食時、安静時状態の異常、および/またはインスリン、急性運動、および/または複数の筋肉群を動員する高強度インターバル トレーニングの影響の障害によって特徴付けられるという仮説を立てています。

1. インスリン感受性、体組成、心肺機能、基質代謝
2. インスリン感受性に合わせて調整されたインスリン分泌
3. 筋肉のインスリンシグナル伝達の遠位成分と調節因子、および筋肉と脂肪のミトコンドリアダイナミクスとマイトファジーのマーカー
4. 脂肪滴機能の調節因子、および筋肉と脂肪のミトコンドリアとの相互作用
5. 筋肉代謝を調節する転写およびシグナル伝達ネットワーク
6. 筋肉と脂肪の代謝酵素とシグナル伝達酵素のリン酸化とアセチル化
7. 脂肪における脂肪組織の拡張性の調節因子
8. 血漿、脂肪、筋肉のメタボローム シグネチャ

方法 代謝特性評価および組織生検 人体計測および生化学分析: すべてのコホートの参加者は、ベースライン クランプ研究の少なくとも 1 週間前に検査されます。 これには、性別、年齢、BMI、血圧、心電図の評価が含まれます。 抗GAD65抗体、HbA1c、スクリーニング血液検査、血漿グルコース、FFA、脂質プロファイル、アディポネクチン、レプチン、血清インスリン、およびC-ペプチドの一晩の空腹時レベル。 VO2max は、間接熱量測定法を使用したサイクル エルゴメーターの段階的最大テストによって決定されます (8,35)。 全身組成 (除脂肪体重、総脂肪量、および局所脂肪量) は、Hologic Discovery デバイス (ウォルサム、マサチューセッツ州、米国) を使用した DXA スキャンによって決定されます。 やせ型および太りすぎ/肥満のコントロールは、耐糖能異常（IGT）を除外するために、2時間の標準（75g）経口耐糖能試験によって検査されます。

正常血糖-高インスリンクランプ:運動トレーニングプログラムの前(ベースライン)および後、参加者は、記載されているように、正常血糖-高インスリンクランプ(4時間のインスリン40mU/分/m2)によって12時間の一晩絶食後に検査されます(4- 7）。 クランプは、ブドウ糖のボーラス (0.3 g/kg 体重) を使用した 60 分間の静脈内ブドウ糖負荷試験 (IVGGT) と組み合わされます。 インスリン分泌は、それぞれ最初の 10 分間と最後の 50 分間の第 1 段階と第 2 段階のインスリン応答の推定値によって評価されます。 組織生検は以下に記載するように行う。 この研究は、グルコーストレーサーおよび間接熱量測定と組み合わされ、グルコース処理速度、グルコースと脂質の酸化、および非酸化的グルコース代謝とエネルギー消費の推定を可能にします。 体脂肪率（％）は、生体インピーダンス法により測定されます。

骨格筋と脂肪の生検：各クランプの基礎およびインスリン刺激状態で、mからの骨格筋生検。外側広筋および皮下の腹部脂肪生検は、局所麻酔下で吸引を伴う修正された Bergström 針を使用して行われます (4-9)。 各筋生検の半分と各脂肪生検のすべてを液体窒素で 30 秒以内に急速凍結し、後の分析のために -130 °C で保存します。 各筋肉生検の 3 分の 1 は、氷冷した分離バッファーに入れて、高解像度の呼吸測定のために研究室にすぐに運ばれます (以下を参照) (106)。 筋肉の小片 (~5 mg) を Tissue-Tek に埋め込み、免疫組織化学分析のために液体窒素で凍結します。 筋肉の小さな立方体 (1 mm3) は、緩衝グルタルアルデヒドで前固定され、電子顕微鏡検査用に四酸化オスミウムで後固定されます (73)。

運動介入 急性運動：ベースラインクランプの後、しかし運動トレーニングプログラムの開始前に、急性運動の効果が研究されます。 仰臥位で 30 分間安静にした後、血液サンプルと筋肉生検の最初のセットを採取します (上記参照)。 次に、被験者はサイクルエルゴメーターで30分間の有酸素運動を行います（その後、VO2peakの60％の強度でローイングマシンで30分間（30分間））。 血液サンプルは 15 分ごとに採取され、酸素消費量は間接熱量測定によって測定されます。 運動の試合後、被験者が仰臥位で休んでいる間に 2 回目の筋生検が行われます。最後に、回復の 4 時間後に 3 回目の筋生検が行われます (上記参照)。

運動トレーニング: すべての参加者で、8 週間の教師付き高インターンシティ インターバル トレーニング (HIIT) の効果も調査されます。 HIIT プロトコルは、ローイングとサイクリングを 5 x 1 分間の高強度インターバルのトレーニング ブロックに組み合わせた週 3 回のセッションで構成され、それぞれに 1 分間のアクティブまたは休息回復が散在しています。 トレーニング ブロックの間に、参加者は 4 分間の休憩を取り、ボートからサイクリングに、またはその逆に切り替えます。 セッションあたりのブロック数は、2 週間ごとに追加のブロックが追加され、1 ～ 2 週目の 2 ブロックから 7 ～ 8 週目の 5 ブロックに徐々に増加します。

VO2max テストと DEXA スキャン (体組成) は、トレーニング期間の後、トレーニング後の最後のクランプの 48 時間前に実行されます。 トレーニング強度を調整するために、4 週目と 6 週目にさらに VO2 max を測定します。 トレーニングプログラムの前後（48時間）、すべての研究参加者は、上記のように正常血糖-高インスリンクランプおよび組織生検によって検査されます。

骨格筋および脂肪組織生検の研究 ミトコンドリア呼吸: 透過処理された筋線維のミトコンドリア呼吸の測定は、説明されているように (96)、高解像度呼吸計 (Oroboros Instruments) を使用して 2 回行われます。 アデニレートの非存在下での通常の呼吸 (状態 2) は、複合体 I 基質供給のためのリンゴ酸とグルタミン酸の添加、続いて ADP 刺激による状態 3 呼吸によって評価されます。 次にコハク酸を加えて、複合体 I および II への収束電子入力を評価します。 ミトコンドリア外膜の完全性は、シトクロム c の添加によって確立されます。 このメソッドは、非常に小さな生検サンプルを使用してその場でミトコンドリアの研究を許可します。

定量的リアルタイム PCR (qRT-PCR) およびウェスタンブロッティング: 記述されているように (67,97)、追加のフェノール-クロロホルムステップを含む TRIzol プロトコルを使用して、筋肉および脂肪生検 (上記の研究中に得られた) から全 RNA を抽出します。 RNA の量は分光光度計で測定され、高品質の RNA は Agilent 2100 バイオアナライザーと分解計ソフトウェアを使用して評価されます。 すべてのサンプルからの全 RNA を DNAse I で処理し、TaqMan 逆転写試薬とランダム ヘキサマー プライマー (Applied Biosystems) を使用して一本鎖 cDNA に逆転写します。 すべての関連遺伝子の TaqMan 遺伝子発現アッセイと TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) を使用して、Applied Biosystems Prism 7700 を使用して遺伝子発現の変化を定量化します。 ハウスキーピング遺伝子は、介入に応じた変化についてテストされ、これらの遺伝子の中で最も安定した3つが遺伝子発現レベルを正規化するために使用されます. オーデンセ大学病院の臨床遺伝学科と協力して、Affymetrix アレイを使用してマイクロアレイベースの mRNA および miRNA プロファイリングを実行します。 目的のすべての酵素のタンパク質存在量とリン酸化は、市販の抗体を使用するか、国際協力者からの抗体を使用して、記載されている (4-10) ウェスタンブロッティング手順により、ヒト骨格筋および脂肪生検 (上記の研究中に得られた) で研究されます。 .

提案の背景で概説したように、インスリンシグナル伝達、Wntシグナル伝達、および脂肪組織の拡張性、ミトコンドリアダイナミクスとマイトファジー、LD機能の他の調節因子に関与する複数の遺伝子/酵素のmRNAレベルとタンパク質含有量および/またはリン酸化を測定します。運動によって調節される転写およびシグナル伝達ネットワーク。

TEM および免疫金標識: 異なる介入の前後の研究コホートからの筋肉生検における LD とミトコンドリア間の形態、体積、局在化、および物理的相互作用は、説明されているバイアスのないステレオロジーの原則を使用して透過型電子顕微鏡 (TEM) によって決定されます。 (83,98)。 に対する抗体を用いた免疫金標識。 PLIN5、PLIN3、および SNAP23 は、85,99) で説明されているように、これらの LD および他のタンパク質とヒト骨格筋のミトコンドリアとの相互作用を局在化および定量化するために TEM 研究で使用されます。

偏りのないターゲットを絞った MS/MS ベースの定量的プロテオミクス: まず、等圧標識 ( iTRAQ) またはタンデム マス ギャグ (TMT)。 その後、確認されたリジンのアセチル化およびリン酸化部位のリストにより、主要な代謝経路に関与する筋肉および脂肪酵素に関するこれらの研究が特定され、選択されたシグナル伝達カスケードが作成され、標的分析に使用されます。 説明されているように（100）、新しい高感度 LC-MS/MS システムを使用して、選択反応モニタリング（SRM）と呼ばれる新しい標的定量的プロテオミクス アプローチを利用します。 この方法により、数百のリジンアセチル化およびリン酸化部位を、1回の実験で全筋肉ライセートまたは単離されたミトコンドリアで確実に定量化できます。

メタボロミクス: メタボロミクスは、生物学的サンプルに含まれるすべての代謝物を表すメタボロームの研究です。 この複雑さには、洗練された分離および検出方法が必要です。 包括的かつ定量的な分析を使用することにより、広いダイナミックレンジ内で前駆体、誘導体、および分解生成物を含む広範囲の代謝物を検出することが可能です (101)。 分析化学、特に液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) およびガスクロマトグラフィー質量分析法 (GC-MS) の最近の発展と、ビッグデータを分析するための広範なソフトウェア ツールの利用可能性により、非常に多数の検出、識別、および定量化が可能になっています。組織、血液、尿などの体液中のマイクロおよびナノモル範囲の分子の量 (102)。 トランスクリプトミクスやプロテオミクスと比較して、メタボロームは化学的にはるかに多様であるため、メタボローム全体に関する偏りのない完全な情報を得るには、さまざまな抽出および分析方法を含む複数のアプローチを適用する必要があります。 このプロジェクトでは、LC-MS と GC-MS ベースのメタボロミクスの両方を使用します。

筋管、脂肪細胞、およびマウスの遺伝子操作: 肥満および T2D で調節不全であることが判明した遺伝子およびタンパク質を使用して、C2C12 筋細胞および 3T3-L1 脂肪細胞の遺伝子操作を使用したメカニズム研究を設計します。 現在、C2C12 細胞と 3T3-L1 脂肪細胞を確立し、トランスフェクションによる遺伝子のノックダウン (siRNA) と過剰発現のための設備を確立しています。 マウスモデルにおける筋肉および脂肪組織特異的トランスフェクションおよび/または遺伝子のノックアウトに関しては、August Krogh での Jørgen Wojtaszewski 教授との共同研究により、AMPK α1/α2、mTORC2 の筋肉特異的ノックアウトへのアクセスが可能になります。 、RAC1 および PGC1α 、これらは、ヒトの筋肉で観察された異常への影響または関与をテストするために使用できます。 さらに、英国オックスフォード大学のオックスフォード糖尿病・内分泌・代謝センター (OCDEM) の Fredrik Karpe 教授のグループとの共同研究により、Wnt の重要な酵素の研究のために、不死化培養ヒト脂肪細胞の遺伝子操作を実行することができます。 -シグナリング。