Anomalías en los efectos de la insulina y el ejercicio sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos en la obesidad y la diabetes tipo 2

ANTECEDENTES La resistencia a la insulina (IR) juega un papel importante en el aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular (ECV) en la obesidad y la diabetes tipo 2 (T2D). Sin embargo, el tratamiento dirigido de la RI en los tejidos afectados es casi inexistente, excepto para la pérdida de peso y la actividad física. La hipótesis central de esta propuesta es que las anomalías en el metabolismo de la glucosa y los lípidos, así como los defectos en los procesos moleculares regulados por la insulina y el ejercicio, pueden explicar el vínculo entre la RI, la disfunción mitocondrial y la acumulación de lípidos observada en el músculo esquelético en la obesidad y la DT2. Centrándonos en estas anomalías metabólicas y moleculares, el principal objetivo de nuestro proyecto es descubrir nuevos objetivos para el tratamiento de la RI y la simulación del ejercicio, que se pueden utilizar en la prevención y el tratamiento de la diabetes tipo 2 y las enfermedades cardiovasculares.

La diabetes Tipo 2, la obesidad y otras condiciones de alto riesgo se caracterizan por IR en el músculo esquelético, el sitio principal de eliminación de glucosa mediada por insulina (1-3). En T2D, la falla de las células β pancreáticas para compensar esta anomalía provoca hiperglucemia, lo que agrava aún más el riesgo de ECV. A pesar de la extensa investigación, los mecanismos metabólicos y moleculares exactos que subyacen a la IR no se comprenden completamente. A nivel metabólico, los investigadores y otros han demostrado que la RI en la obesidad y la DT2 se caracteriza por una captación de glucosa y un almacenamiento de glucosa alterados por la insulina, pero también por un aumento reducido de la oxidación de la glucosa mediado por la insulina y una supresión atenuada de la oxidación de los lípidos y los niveles circulantes de glucosa. ácidos grasos libres (lipólisis) en respuesta a la insulina (2,3). A nivel molecular, estas anomalías metabólicas se asocian con una señalización reducida de la insulina para el transporte de glucosa a través de IRS-1, PI3K, Akt, AS160 y RAC1 y con la síntesis de glucógeno a través de una acción deficiente de la insulina sobre la glucógeno sintasa en el músculo esquelético (1-10). Además, la IR se asocia consistentemente con la acumulación de contenido de lípidos y diferentes medidas de disfunción mitocondrial en el músculo esquelético de pacientes con DT2, obesidad e individuos de alto riesgo (1-3,11,12).

Además, hay evidencia acumulada de aumento de la glucólisis (13-15) y resistencia al efecto beneficioso del ejercicio en la diabetes tipo 2 y la obesidad (16-18). Los cambios en el metabolismo del sustrato en condiciones de IR parecen estar asociados con una firma metabolómica específica que incluye niveles circulantes elevados de aminoácidos de cadena ramificada y α-hidroxibutirato, y niveles reducidos de glicina (19-23). Finalmente, el deterioro de la capacidad de expansión del tejido adiposo en la diabetes tipo 2, la obesidad y otras condiciones de alto riesgo puede desempeñar un papel en la patogenia de la IR y la diabetes tipo 2 al conducir a una mayor secreción de factores inflamatorios y al desbordamiento de ácidos grasos libres para causar la deposición ectópica de lípidos en el hígado y el músculo. 24). Las variantes genéticas que se han encontrado asociadas con la DT2, la obesidad y la composición corporal en grandes estudios GWAS sugieren un papel para varios factores transcripcionales y vías de señalización en la expansión e inflamación del tejido adiposo (25,26).

Efectos del ejercicio: La actividad física juega un papel fundamental en la prevención y tratamiento de la DT2 (27-29). Por lo tanto, el metanálisis de varios estudios de entrenamiento físico a largo plazo (> 8 semanas) ha demostrado que el ejercicio puede mejorar la composición corporal, la sensibilidad a la insulina y reducir la Hb1Ac en aproximadamente un 0,67 % en pacientes con DT2 (30). Los efectos beneficiosos de una sola sesión de ejercicio con una sola pierna de intensidad moderada incluyen un aumento inmediato en la captación de glucosa muscular (31). Esto es seguido por un más prolongado (

Modo de ejercicio: Aún no se ha establecido el modo de ejercicio más apropiado para las personas con IR. Un problema importante a este respecto es encontrar un modo efectivo de ejercicio (tipo, intensidad y duración) que asegure un compromiso continuo (adherencia del paciente) así como efectos beneficiosos continuos sobre la salud (29). Por lo tanto, para las personas con IR es importante identificar un modo de ejercicio que pueda maximizar el gasto de energía de manera segura y efectiva. Estos podrían ser modos de ejercicio que no soportan peso, como el ciclismo y el remo. La mayoría de los estudios hasta ahora han informado los efectos del ejercicio agudo o el entrenamiento de resistencia en bicicletas estáticas. Sin embargo, se ha demostrado que el gasto energético y la oxidación de grasas durante el remo es mayor que durante el ciclismo (39,40). La fuerte asociación entre la IR, la acumulación de lípidos y la disfunción mitocondrial en el músculo hace que el ejercicio para quemar grasa sea de especial interés (29,40). La contribución de la oxidación de grasas al gasto de energía es mayor durante el ejercicio de intensidad baja y moderada (45-65 % del VO2max) (41-43). Por lo tanto, la combinación de ciclismo y remo a intensidades moderadas podría ser un modo de ejercicio atractivo debido a su naturaleza sin soporte de peso y por la participación de los grupos musculares de la parte superior e inferior del cuerpo (29). En nuestros estudios, evaluaremos por primera vez el efecto y la tolerabilidad de un protocolo de entrenamiento interválico de alta intensidad que combine ciclismo y remo en ergómetros sobre la sensibilidad a la insulina, la composición corporal, la aptitud cardiorrespiratoria, la función de las células beta pancreáticas y los reguladores metabólicos y moleculares de la glucosa. absorción y metabolismo energético en la obesidad y la DM2 frente a controles del mismo peso.

Resistencia al ejercicio: el entrenamiento físico es un aspecto esencial en la prevención de la DT2 (27,28). El ejercicio agudo y el entrenamiento de resistencia mejoran la sensibilidad a la insulina, también en la obesidad y la DT2 (34). El ejercicio activa varias vías de señalización, lo que da como resultado la regulación positiva de las redes transcripcionales que regulan la biogénesis mitocondrial, el metabolismo de la glucosa y los ácidos grasos y la remodelación muscular (44). Esto incluye niveles elevados de microARN específicos de músculo (miARN), activación de receptores nucleares como la subfamilia NR4As, la familia PPAR y otros factores de transcripción (45-50). Esto sucede junto con la estimulación inducida por el ejercicio de PGC-1α, que promueve la fosforilación oxidativa y la oxidación de ácidos grasos al mejorar la biogénesis mitocondrial (51). Esto parece estar mediado por la activación de AMPK, p38 MAPK, CamK-II, CREB y otros reguladores aguas arriba (51-53). Además, el ejercicio aumenta la actividad y/o los niveles de proteínas involucradas tanto en el ejercicio como en la señalización mediada por insulina para el transporte de glucosa, como Akt, AMPK, TBC1D4 y RAC1 (8,10,34,35,54,55). En la última década, varios informes han indicado una respuesta deficiente al ejercicio en diferentes condiciones de IR. Por lo tanto, en T2D de inicio temprano y condiciones prediabéticas como la obesidad y los familiares de primer grado de pacientes con T2D se ha informado una falta de aumento en el VO2max y la sensibilidad a la insulina en respuesta al ejercicio agudo o al entrenamiento con ejercicios (16-18,56, 57). A nivel molecular, estas anomalías se asociaron con un aumento alterado de PGC-1α y otros reguladores de la biogénesis y la dinámica mitocondrial (16-18,56,57). Esto sugiere la existencia de "resistencia al ejercicio" en T2D y otras condiciones IR comunes. Sin embargo, aún no se han establecido las redes transcripcionales y de señalización que subyacen a estos efectos del ejercicio agudo sobre la sensibilidad a la insulina y el VO2 máx. en el músculo humano, y las posibles alteraciones metabólicas y moleculares en la obesidad y la diabetes tipo 2. Además, debido a los diseños de estudio inapropiados en la mayoría de estos estudios, no está claro en qué medida estos hallazgos están relacionados con el sobrepeso/obesidad per se. Una mejor comprensión de las redes transcripcionales y de señalización reguladas por el ejercicio agudo y el entrenamiento físico será crucial para diseñar intervenciones de estilo de vida en individuos con IR para prevenir la DT2.

Dinámica mitocondrial y mitofagia: Numerosos estudios han implicado un vínculo entre la IR y la disfunción mitocondrial en la DM2, la obesidad y otras afecciones de alto riesgo (1,11,12). Esto parece implicar tanto una alteración de la biogénesis mitocondrial como un contenido reducido, una alteración intrínseca y cambios morfológicos de las mitocondrias musculares (58-66). Se cree que la disfunción mitocondrial junto con un aumento del suministro de lípidos en condiciones de RI provoca la acumulación de lípidos, lo que agrava aún más la RI al provocar una modulación negativa de la señalización de la insulina (1,11). Se ha debatido si la IR es la causa o la consecuencia de la disfunción mitocondrial. Recientemente, los investigadores y otros han demostrado que la RI heredada da como resultado diferentes marcadores de contenido mitocondrial reducido (67,68). Esto está respaldado por datos que muestran que la insulina aumenta los niveles de ARNm y la abundancia de proteínas mitocondriales, así como los flujos de ATP en el músculo esquelético humano (69-71). Curiosamente, datos recientes indican que la insulina regula las proteínas de fisión (DRP1, FIS1) y fusión (MFN1/2, OPA1) que rigen la dinámica mitocondrial, así como las enzimas involucradas en la eliminación de las mitocondrias dañadas (mitofagia) como LC3B, Mul1 y BNIP3/. 3L y AMPK y fosforilación de ULK1 mediada por mTOR (72-76). Estudios recientes han demostrado que el factor de fisión mitocondrial (MFF) es un sustrato directo de AMPK en respuesta al ejercicio, y demostraron que la activación de AMPK promueve la fisión mitocondrial mediante la estimulación de MMF y DRP1 (77). Por lo tanto, los defectos en la regulación de la dinámica mitocondrial y la mitofagia mediada por la insulina y el ejercicio podrían contribuir a la disfunción mitocondrial en la IR. Queda por investigar en qué medida tales anomalías están presentes en el músculo esquelético y/o la grasa en pacientes con diabetes tipo 2 e individuos de alto riesgo con obesidad.

Acumulación de lípidos: La acumulación de lípidos en el músculo esquelético está fuertemente asociada con la RI y el desarrollo de T2D (2,78). Los ácidos grasos se almacenan como triglicéridos en orgánulos conocidos como gotas de lípidos (LD). La biosíntesis de triglicéridos implica varias isoformas de GPAT, AGPAT, lipinas y DGAT (79), mientras que la lipólisis intramuscular, p. en respuesta al ejercicio, parece involucrar ATGL, CGI-58 y HSL (80). Múltiples proteínas se unen a la superficie de LD para regular el tráfico de membranas, el recambio de lípidos, la fusión y formación de LD, así como la interacción con otros orgánulos, incluidas las mitocondrias (78,81,82). Esto incluye las proteínas SNARE, STX5, SNAP23, VAMP4, así como las proteínas de recubrimiento LD (perilipinas) como PLIN2, PLIN3 y PLIN5 (anteriormente conocidas como ADRP, TIP47 y OXPAT). Existe evidencia de que el ejercicio aumenta la interacción física entre LD y las mitocondrias en el músculo esquelético humano (83), y que la interacción con las mitocondrias involucra proteínas específicas asociadas a LD como PLIN5, PLIN3 y SNAP23 (84-86). No se ha investigado previamente en detalle cómo las múltiples proteínas involucradas en la biosíntesis de triglicéridos, la lipólisis mediada por el ejercicio, la formación de LD y la interacción con las mitocondrias están reguladas por la insulina y el ejercicio en el músculo esquelético humano en pacientes con diabetes tipo 2 e individuos de alto riesgo con obesidad. Los estudios de estos mecanismos en el músculo esquelético humano in vivo están garantizados para evaluar su posible relación con la acumulación de lípidos, la disfunción mitocondrial y la alteración de la señalización de insulina en IR.

Fosforilación y acetilación de lisina de enzimas en las principales vías metabólicas: además de la disfunción mitocondrial y la acumulación de lípidos, los investigadores y otros han proporcionado evidencia de una mayor glucólisis en el músculo esquelético en la obesidad y la DT2 (13-15). En varios estudios proteómicos, los investigadores han mapeado los proteomas y fosfoproteomas del músculo humano y mitocondrias aisladas (97-100). Junto con los informes de otros grupos, estos estudios han demostrado que las enzimas involucradas en la glucólisis, el metabolismo de los ácidos grasos, el ciclo de Krebs y OxPhos son muy abundantes y en gran medida modificados tanto por la fosforilación como por la acetilación de lisina en el músculo (89-92). Además, los investigadores han demostrado que la insulina regula la fosforilación de las proteínas mitocondriales en el músculo esquelético humano (93). Esto incluyó componentes del sistema organizador de la membrana interna mitocondrial recientemente definido (MINOS), que es importante para la morfología de las crestas y la respiración mitocondrial. Además, recientemente se demostró que la acetilación de lisina de las proteínas mitocondriales se correlaciona con la sensibilidad a la insulina, mientras que la acetilación de la translocasa 1 de ADP/ATP (ANT1) se redujo en respuesta al ejercicio (94). De particular interés, un estudio reciente indicó que la acetilación de lisina en el 50% de los casos interactuó con la fosforilación en los mismos péptidos, lo que sugiere una diafonía, y por este mecanismo regula la actividad de quinasas como AMPK, AKT y PKA (92). Una mejor comprensión de esta interacción es crucial para comprender la regulación postraduccional de las enzimas en las principales vías metabólicas y de señalización. La acetilación aberrante de lisina puede involucrar a las desacetilasas citosólicas y mitocondriales, Sirt1 y Sirt3, que se sabe que regulan, p. AMPK, PGC-1alfa y múltiples proteínas mitocondriales, así como enzimas críticas en la señalización de la insulina y otras vías moleculares (95). La posible regulación de la acetilación y fosforilación de lisina y su interacción por parte de la insulina y el ejercicio en individuos con y sin RI no se ha investigado antes, y puede proporcionar información importante y sustancial relacionada con la RI, la glucólisis mejorada, la alteración de la señalización de la insulina, la disfunción mitocondrial y la acumulación de lípidos.

Capacidad de expansión del tejido adiposo: metaanálisis GWAS recientes han identificado múltiples loci genéticos asociados con medidas de distribución de la grasa corporal (cintura, cadera y WHR), independientemente del IMC (25,26) Muchos de estos loci están ubicados dentro y/o cerca de los genes implicados en el desarrollo o la función de los adipocitos, sino también en la adipogénesis, la angiogénesis, la regulación transcripcional y la resistencia a la insulina como procesos que influyen en las diferencias de distribución. La distribución del tejido adiposo parece intrínseca al individuo y es probable que dependa de factores hereditarios como las variantes genéticas. El análisis de la composición corporal ha determinado la expansión relativa de la grasa subcutánea (SAT) frente a la grasa ectópica (visceral, hepática y muscular) con la sobrealimentación. Dichos estudios han contribuido a la hipótesis de la capacidad de expansión del tejido adiposo según la cual el SAT tiene una capacidad finita para expandirse y una vez que se excede la capacidad se produce la deposición ectópica de triglicéridos (24). El potencial de expansión de SAT confiere protección/predispone a las respuestas metabólicas adversas a la sobrealimentación. El concepto de un umbral de grasa personal sugiere una gran variación interindividual en la capacidad de SAT con expansión de depósito ectópico/descompensación metabólica una vez que se supera el propio umbral. Aún no se han establecido las posibles vías moleculares y de señalización involucradas en la capacidad de expansión del tejido adiposo deteriorada en personas con diabetes Tipo 2 y prediabetes. Además, no se sabe si el ejercicio puede modular la capacidad de expansión del tejido adiposo a través de mecanismos moleculares específicos.

Metabolómica: Durante la última década, se han propuesto varios metabolitos como posibles biomarcadores metabólicos de la resistencia a la insulina y la intolerancia a la glucosa (19-21). En particular, se han sugerido niveles circulantes alterados de metabolitos relacionados con las vías afectadas por la insulina, como la lipólisis, la cetogénesis, la proteólisis y el metabolismo de la glucosa (21). Los estudios de perfiles metabólicos de personas no diabéticas han informado niveles alterados de fosfolípidos, triglicéridos, hexosas, α-hidroxibutirato, glicina, glutamina y aminoácidos aromáticos y de cadena ramificada como biomarcadores tempranos de resistencia a la insulina, intolerancia a la glucosa y el desarrollo de diabetes tipo 2 (19-23). Sin embargo, queda por determinar en qué medida el ejercicio agudo y el entrenamiento físico cambian los metabolitos hacia una firma metabólica normal en la obesidad y la diabetes tipo 2.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS GENERALES Como se describió anteriormente, los investigadores plantean la hipótesis de que la RI y su asociación con la disfunción mitocondrial y la acumulación de lípidos en el músculo esquelético humano implican anomalías en la regulación de la insulina mediada por el ejercicio y la insulina.

1. sensibilidad a la insulina y metabolismo energético,
2. señalización de insulina,
3. dinámica mitocondrial y mitofagia,
4. función de las gotas de lípidos e interacción con las mitocondrias,
5. acetilación y fosforilación de enzimas en las principales vías metabólicas y de señalización, así como
6. redes transcripcionales y de señalización que regulan la biogénesis mitocondrial y el metabolismo de sustratos.

Además, los investigadores plantean la hipótesis de que al menos algunas de estas anomalías están relacionadas con la capacidad de expansión del tejido adiposo alterada debido a la regulación alterada de factores de transcripción específicos o vías de señalización. Finalmente, estas anormalidades darán como resultado firmas metabolómicas, que pueden usarse para detectar y prevenir el desarrollo de T2D y ECV.

En esta propuesta, los investigadores planean una serie de estudios, en los que combinamos la caracterización metabólica de última generación y una intervención novedosa de entrenamiento físico con investigaciones detalladas de muestras de sangre, músculo esquelético y biopsias de grasa con el objetivo de identificar defectos. en los nuevos sistemas reguladores mencionados anteriormente y examinar su posible relación con las anomalías conocidas en la señalización de la insulina, el metabolismo de la glucosa y los lípidos y la función mitocondrial en la obesidad y la diabetes tipo 2. Se obtendrá una mayor comprensión del mecanismo mediante una mayor caracterización de dichos defectos en miotubos y adipocitos cultivados, así como en modelos de ratones en estrecha colaboración con nuestros socios de investigación. En última instancia, los investigadores esperan que esto nos ayude a identificar nuevos objetivos para el tratamiento de la RI y la simulación del ejercicio, que actualmente faltan en el tratamiento y la prevención de la DT2 y la ECV.

HIPÓTESIS ESPECÍFICAS

En comparación con los controles emparejados, los investigadores plantean la hipótesis de que las personas con obesidad y DM2 se caracterizan por anomalías en el ayuno, el estado de reposo y/o un efecto deficiente de la insulina, el ejercicio agudo y/o el entrenamiento de intervalos de alta intensidad que recluta varios grupos musculares en:

1. sensibilidad a la insulina, composición corporal, aptitud cardiorrespiratoria y metabolismo de sustratos
2. Secreción de insulina ajustada por sensibilidad a la insulina
3. componentes distales y moduladores de la señalización de insulina en músculo y marcadores de dinámica mitocondrial y mitofagia en músculo y grasa
4. reguladores de la función de las gotas de lípidos y la interacción con las mitocondrias en el músculo y la grasa
5. redes transcripcionales y de señalización que regulan el metabolismo muscular
6. fosforilación y acetilación de enzimas metabólicas y de señalización en músculo y grasa
7. reguladores de la capacidad de expansión del tejido adiposo en la grasa
8. firma metabolómica en plasma, grasa y músculo

MÉTODOS Caracterización metabólica y biopsias de tejido Antropometría y análisis bioquímico: Los participantes en todas las cohortes serán examinados al menos 1 semana antes de los estudios de pinzamiento de referencia. Esto incluirá la evaluación del sexo, la edad, el IMC, la presión arterial y el ECG. Niveles en ayunas durante la noche de anticuerpos anti-GAD65, HbA1c, análisis de sangre de detección, glucosa plasmática, FFA, perfil de lípidos, adiponectina, leptina, insulina sérica y péptido C. El VO2max se determina mediante una prueba máxima graduada en un cicloergómetro usando calorimetría indirecta (8,35). La composición corporal total (masa corporal magra, masa grasa total y regional) se determinará mediante exploraciones DXA utilizando un dispositivo Hologic Discovery (Waltham, MA, EE. UU.). Los controles delgados y con sobrepeso/obesidad se examinarán mediante una prueba de tolerancia oral a la glucosa estándar de 2 h (75 g) para excluir la intolerancia a la glucosa (IGT).

Pinza euglucémica-hiperinsulinémica: Antes (línea de base) y después del programa de entrenamiento físico, los participantes son examinados después de un ayuno nocturno de 12 h con una pinza euglucémica-hiperinsulinémica (insulina 40 mU/min/m2 durante 4 h) como se describe (4- 7). Las pinzas se combinan con una prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa (IVGGT) de 60 min utilizando un bolo de glucosa (0,3 g/kg de peso corporal). La secreción de insulina se evalúa mediante estimaciones de las respuestas de insulina de primera y segunda fase durante los primeros 10 min y los últimos 50 min, respectivamente. Se toman biopsias de tejido como se describe a continuación. Los estudios se combinan con trazadores de glucosa y calorimetría indirecta que permiten estimar las tasas de eliminación de glucosa, la oxidación de glucosa y lípidos, y el metabolismo de la glucosa no oxidativa y el gasto de energía. La grasa corporal (%) se determina por el método de bioimpedancia.

Biopsias de músculo esquelético y grasa: en los estados basal y estimulado por insulina de cada pinza, las biopsias de músculo esquelético de m. Se toman biopsias de vasto lateral y grasa abdominal subcutánea utilizando una aguja de Bergström modificada con succión bajo anestesia local (4-9). La mitad de cada biopsia de músculo y la totalidad de cada biopsia de grasa se congelan rápidamente en nitrógeno líquido en 30 s y se almacenan a -130 °C para análisis posteriores. Un tercio de cada biopsia de músculo se transporta inmediatamente en un tampón de aislamiento helado al laboratorio para una respirometría de alta resolución (ver más abajo) (106). Se incrustan pequeños trozos de músculo (~5 mg) en Tissue-Tek y se congelan en nitrógeno líquido para el análisis inmunohistoquímico. Se prefijan pequeños cubos de músculo (1 mm3) en glutaraldehído tamponado y se posfijan en tetróxido de osmio para microscopía electrónica (73).

Intervenciones de ejercicio Ejercicio agudo: después del pinzamiento inicial, pero antes del inicio del programa de entrenamiento físico, se estudiarán los efectos del ejercicio agudo. Después de descansar en posición supina durante 30 minutos, se toma la primera serie de muestras de sangre y biopsias musculares (ver arriba). Luego, los sujetos realizan una serie de ejercicio aeróbico durante 30 min en un cicloergómetro (seguido de 30 min en una máquina de remo (30 min) a una intensidad del 60 % del VO2máx. Se toman muestras de sangre cada 15 min y se mide el consumo de oxígeno por calorimetría indirecta. Después de la sesión de ejercicio, se toman las segundas biopsias musculares mientras los sujetos descansan en posición supina. Finalmente, se tomará un tercer conjunto de biopsias musculares 4 horas después de la recuperación (ver arriba).

Entrenamiento físico: en todos los participantes, también se investigarán los efectos del entrenamiento de intervalos de alta intensidad (HIIT) supervisado de 8 semanas. El protocolo HIIT consta de 3 sesiones semanales combinando remo y ciclismo en bloques de entrenamiento de 5 x 1 min de intervalos de alta intensidad cada uno intercalados con 1 min de recuperación activa o en reposo. Entre los bloques de entrenamiento, los participantes tienen un descanso de 4 minutos en el que cambiaron de remo a ciclismo y viceversa. El número de bloques por sesión se incrementa gradualmente con un bloque adicional agregado cada dos semanas, pasando de 2 bloques en la semana 1-2 a 5 bloques en la semana 7-8.

Las pruebas de VO2max y los escaneos DEXA (composición corporal) se realizan después del período de entrenamiento, pero 48 horas antes del cierre final posterior al entrenamiento. El VO2 max se determina además después de la semana 4 y 6 para ajustar las intensidades de entrenamiento. Antes y después (48 h) del programa de entrenamiento, todos los participantes del estudio serán examinados mediante una pinza euglucémica-hiperinsulinémica y biopsias de tejido como se describe anteriormente.

Estudios de músculo esquelético y biopsias de tejido adiposo Respiración mitocondrial: Las mediciones de la respiración mitocondrial en fibras musculares permeabilizadas se realizan por duplicado usando un respirómetro de alta resolución (Oroboros Instruments) como se describe (96). La respiración de rutina (estado 2) en ausencia de adenilatos se evalúa mediante la adición de malato y glutamato para el suministro de sustrato del complejo I, seguido de respiración de estado 3 estimulada por ADP. Luego se agrega succinato para evaluar la entrada de electrones convergentes al Complejo I y II. La integridad de la membrana mitocondrial externa se establece mediante la adición de citocromo c. Este método permite estudios de mitocondrias in situ utilizando muestras de biopsia muy pequeñas.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) y transferencia Western: el ARN total se extrae de biopsias de músculo y grasa (obtenidas durante los estudios descritos anteriormente) mediante el protocolo TRIzol con un paso adicional de fenol-cloroformo como se describe (67,97). La cantidad de ARN se determina con un espectrofotómetro y el ARN de alta calidad se evalúa utilizando el software Agilent 2100 Bioanalizador y degradómetro. El ARN total de todas las muestras se trata con ADNasa I y se transcribe de forma inversa a ADNc monocatenario utilizando reactivos de transcripción inversa TaqMan y cebadores de hexámeros aleatorios (Applied Biosystems). Los ensayos de expresión génica TaqMan para todos los genes relevantes y TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) se utilizan para cuantificar los cambios en la expresión génica utilizando Applied Biosystems Prism 7700. Los genes domésticos se analizarán en busca de cambios en respuesta a las intervenciones, y los tres genes más estables se utilizarán para normalizar los niveles de expresión génica. Realizaremos perfiles de ARNm y miARN basados ​​en micromatrices utilizando matrices Affymetrix en colaboración con el Departamento de Genética Clínica del Hospital Universitario de Odense. La abundancia de proteínas y la fosforilación de todas las enzimas de interés se estudiarán en biopsias de tejido adiposo y músculo esquelético humano (obtenidas durante los estudios descritos anteriormente) mediante procedimientos de transferencia Western como se describe (4-10) utilizando anticuerpos disponibles en el mercado o utilizando anticuerpos de nuestros colaboradores internacionales. .

Como se describe en los antecedentes de la propuesta, mediremos los niveles de ARNm y el contenido de proteínas y/o la fosforilación de múltiples genes/enzimas involucradas en la señalización de la insulina, la señalización de Wnt y otros reguladores de la capacidad de expansión del tejido adiposo, la dinámica mitocondrial y la mitofagia, la función LD, y redes transcripcionales y de señalización reguladas por el ejercicio.

TEM e inmunoetiquetado con oro: la morfología, el volumen y la localización, así como la interacción física entre el LD y las mitocondrias en las biopsias musculares de las cohortes del estudio, antes y después de las diferentes intervenciones, se determinan mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando los principios de la estereología imparcial tal como se describe (83,98). Marcaje con inmunooro utilizando anticuerpos contra, p. PLIN5, PLIN3 y SNAP23 se utilizarán en estudios TEM como se describe 85, 99) para localizar y cuantificar la interacción de estas LD y otras proteínas con las mitocondrias en el músculo esquelético humano.

Proteómica cuantitativa basada en MS/MS objetiva e imparcial: en primer lugar, realizaremos estudios proteómicos basados ​​en MS/MS cuantitativos en modo de descubrimiento de los acetilomas y fosfoproteomas en el músculo y la grasa de personas con obesidad y DT2 utilizando técnicas cuantitativas novedosas, incluido el etiquetado isobárico ( iTRAQ) o Tandem Mass Gag (TMT). Posteriormente, se creará una lista de sitios de acetilación y fosforilación de lisina confirmados identificados en estos estudios sobre enzimas musculares y grasas involucradas en las principales vías metabólicas y cascadas de señalización seleccionadas y se usará para análisis específicos. Aprovecharemos un nuevo enfoque proteómico cuantitativo dirigido llamado monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM) utilizando un nuevo sistema LC-MS/MS de alta sensibilidad como se describe (100). Mediante este método, se pueden cuantificar de forma fiable cientos de sitios de acetilación y fosforilación de lisina en lisados ​​musculares completos o mitocondrias aisladas en un solo experimento.

Metabolómica: La metabolómica es el estudio del metaboloma, que representa todos los metabolitos que se encuentran en una muestra biológica. Esta complejidad exige métodos sofisticados de separación y detección. Mediante el uso de un análisis completo y cuantitativo, es posible detectar una amplia gama de metabolitos, incluidos precursores, derivados y productos de degradación dentro de un amplio rango dinámico (101). Los desarrollos recientes en química analítica, especialmente la cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) y la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y la disponibilidad de amplias herramientas de software para analizar big data permiten la detección, identificación y cuantificación de números muy grandes. de moléculas en el rango micro y nanomolar en fluidos corporales, como tejidos, sangre y orina (102). En comparación con la transcriptómica y la proteómica, el metaboloma es mucho más diverso químicamente y, por lo tanto, se deben aplicar múltiples enfoques que involucran diferentes métodos analíticos y de extracción para obtener información imparcial y completa sobre todo el metaboloma. En este proyecto, utilizaremos metabolómica basada en LC-MS y GC-MS.

Manipulación genética de miotubos, adipocitos y ratones: los genes y las proteínas que se encuentren desregulados en la obesidad y la DM2 se utilizarán para diseñar estudios mecánicos mediante la manipulación genética de células musculares C2C12 y adipocitos 3T3-L1. Actualmente hemos establecido células C2C12 y adipocitos 3T3-L1 e instalaciones para la eliminación (siRNA) y la sobreexpresión de genes mediante transfección. Cuando se trata de transfección específica de músculo y tejido adiposo y/o eliminación de genes en modelos de ratones, nuestra colaboración con el profesor Jørgen Wojtaszewski en August Krogh nos brinda acceso a la eliminación específica de músculo de AMPK α1/α2, mTORC2 , RAC1 y PGC1α , que pueden usarse para probar su impacto o participación en una anomalía observada en el músculo humano. Además, nuestra colaboración con el grupo del profesor Fredrik Karpe del Oxford Centre for Diabetes, Endocrinology and Metabolism (OCDEM) de la Universidad de Oxford, Reino Unido, nos da acceso para llevar a cabo la manipulación genética de adipocitos humanos cultivados inmortalizados para estudios de enzimas críticas en Wnt. -señalización.