肥満の母親から生まれた新生児 - 糞便マイクロバイオーム移植、RCT (SISU-FMT)

1. 背景

   ここ数十年で、子供の肥満率は世界中で劇的に増加しています。 肥満の小児および青少年は、肥満でない人に比べて成人後に肥満になる可能性が約5倍高くなります。 小児肥満は複雑かつ多因性の結果ですが、肥満の子供たちは出生時にすでに異なる腸内微生物叢を持っているようです。 これまでの研究の多くは、妊娠前の母体のBMIの上昇、過剰な在胎体重増加、妊娠糖尿病（GDM）、帝王切開などの母体の危険因子を小児期の過体重や肥満の危険因子として強調している。 周産期の要因、特に帝王切開による出産や周産期の抗生物質も、幼少期の微生物叢の組成と発達の重要な決定要因であることが確認されています。 しかし、そのメカニズムは明らかではありません。

   肥満や妊娠糖尿病を患っている母親は、肥満に関連した腸内細菌叢を持っていることが報告されています。 微生物叢の変化は、経膣分娩中に子供に伝染する可能性があります。 これまで、メタゲノム配列決定は、乳児における定着の主な原因と腸内微生物叢の垂直伝播を比較するために成功裏に使用されており、経膣分娩中に微生物叢の>70%が母親から新生児に垂直伝播されることが示されました。

   フィンランドでは、帝王切開率が全出生数の 16 ～ 17% から 19.6% に増加しました。 推定世界平均率は同様ですが、帝王切開率は現在の 21.1% から 28.5% に増加すると予想されます。 帝王切開によって、重要な発育期間中に母親から乳児への有益な微生物の垂直伝達が妨げられるという催眠術がかかります。 肥満のリスクに加えて、帝王切開では自己免疫疾患、喘息、さらには一部のがんなどの感染症や慢性疾患のリスクも増加します。

   乳児の帝王切開における新生児マイクロバイオームの回復に関して、さまざまな治療アプローチが提案され、テストされています。 腸内微生物と母親の腸内細菌は、出生後の新生児腸内細菌叢の最も持続的な割合を占めていますが、膣内細菌と母親の膣内細菌はほんの一過性のごく一部を構成します。 2件の研究では、帝王切開で生まれた乳児の糞便微生物叢の組成は、膣内播種によって中断された腸内バクテロイデス株​​の伝播を回復させることに成功したが、一方、帝王切開の乳児への母親の膣微生物叢の経口投与は、微生物叢の組成に目立った影響を及ぼさなかった。 以前の研究では、公表されたプロトコールを用いた母親からの糞便移植が、乳児の腸内細菌叢の発達を首尾よく安全に改変することが示されています。

   重要な発達期間中に乳児の腸内微生物叢を改変することが可能であるという証拠はあるものの、これらの介入の代謝的影響と臨床的意義は不明です。 さらに、どのような種類の微生物叢を、誰から摂取することが長期的に子供の健康にとって最適であるかは不明です。

   研究者らは、新生児は母親から肥満に関連する微生物叢を受け取るため、肥満は垂直感染症である可能性があると仮説を立てている。 さらに、定着源は修正可能な因子であり、早期の糞便微生物叢移植を使用することで変更できます。

2. 研究デザインと方法

2.1. 母親からの糞便および膣サンプルの募集とスクリーニング

助産師と医師は訪問時に参加する可能性のある母親に研究について通知し、参加に興味のある母親には研究看護師が連絡します。 インフォームドコンセントの後、母親はCS予定の遅くとも10～14日前に、以下で説明する潜在的な伝染病の検査を受けます。 母親から糞便サンプル 100 g と血液サンプル 15 mL を採取します。 母親は、書面による指示に従って、糞便を投与サンプルチューブに分割します。 移植用の糞便は、キャップ内のスプーンを使用して空のチューブに収集されます。 母親は研究看護師に、スクリーニングのために採取したチューブをできるだけ早く研究室に届け、新鮮なサンプルから移植が準備されることを知らせます。このプロセスは 6 時間以内に完了します。

新鮮な糞便サンプルは、寄生虫、病原性ウイルスおよび細菌の存在についてスクリーニングされます。 新鮮な糞便サンプルのアリコート (0.125 g) を使用して、サンプルの細菌組成を測定します。 定期的なフォローアップの一環として母体福祉クリニックで膣サンプルがまだ採取されていない場合は、分娩方法の評価のために来院時に膣サンプルが採取されます。

血液検査：全血球計算、赤血球沈降速度、C反応性タンパク質、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ、アルブミン、クレアチニン、HIV、B型、C型、E型肝炎、梅毒トレポネーマ、ヒトT細胞白血病ウイルス、 CMV と EBV

膣および会陰スクリーニング: B 群連鎖球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA)、拡張スペクトル ベータ ラクタマーゼ (ESBL)

糞便スクリーニング: サルモネラ属菌、シゲラ属菌、カンピロバクター・コリ/ジェジュニ、エルシニア・エンテロコリチカ、腸管出血性大腸菌 (EHEC)、腸管侵襲性大腸菌 (EIEC)、腸毒素原性大腸菌 (ETEC)、ビブリオ属菌、プレシオモナス・シゲロイデス、クロストリジウム・ディフィシル、クリプトスポリジウム属、エンタメーバ・ヒストリティカ、ランブル鞭毛虫、ノロウイルス、多剤耐性グラム陰性菌（MDRGN）、バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）、リステリア・モノサイトゲネス、ヘリコバクター・ピロリ、Sars-CoV-2。

2.2 糞便微生物叢移植

母親から採取した新鮮な糞便サンプルの別の部分を移植片として使用します。その目的のために、1 g の糞便を 15 mL の等張食塩水と 10% グリセロールに溶解し、均質化し、移植片の 0.5 mL アリコートを直ちに凍結して保存します。 -80℃で。

トゥルク マイクロバイオーム バイオバンク (トゥルク大学およびトゥルク大学病院) からの正常体重の健康な女性ドナー (18 ～ 35 歳) からの糞便移植。 ドナーは母親と同時に潜在的な伝染病の検査を受けます。

2.3 母子病棟でのフォローアップ

入院中に、生後2～3日目の最初の便から糞便サンプルが採取されます。 最初の授乳後、新生児は下宿病棟で病院のプロトコルに従って追跡調査されます。 これまでの研究では、糞便移植を受けた新生児で発熱がまれに報告されています。 蠕動の増加、下痢、嘔吐、発熱、発疹などの起こり得る有害事象は、患者記録の電子データベースに報告され、研究者によってそこから収集されます。 退院前に子供の体重が測定され、通常は生後 2 日目に小児科医または小児科専門の医師によって退院検査が行われます。

生後 2 日で、SCID および代謝性疾患のスクリーニングサンプルと同時に、かかとから採取された毛細管血液サンプル (100μl) から末梢血単核球 (PBMC) が分離され、-140℃ で保存されます。 血清は分離され、-80℃で保存されます。 細胞は、遺伝子発現レベルを調べるための単一細胞mRNA配列決定や、免疫細胞タイプの分布や活性化や表面受容体などの機能特性を調べるためのフローサイトメトリーによる免疫表現型検査などの分析を受けます。 炎症、免疫および肥満に関連する血清成分は、高多重 Olink またはその他のイムノアッセイによって血清サンプル (10μl) から検査されます。

2.4 退院後のフォローアップ

生後最初の週から、赤ちゃんは通常の国のプロトコルに従って乳児院で追跡されます。 研究の一環として、保護者はオウル大学病院の小児救急科と連絡を取ることができる。

生後 3 か月と 12 か月の時点で、両親は子供の健康に関するオンラインアンケートに回答し、乳児と母親の糞便サンプルを収集して、微生物叢分析用の XXOMNIgeneGUT (DNA genotek、カナダ、オンタリオ州) チューブと、微生物叢分析用の OMNImetGUT チューブに送るように求められます。代謝物を保存し、郵送でトゥルク マイクロバイオーム バイオバンクに転送する前に室温で一時的に保管します。 可能であれば、生後 3 か月で、2 回目の経口ロタウイルスワクチン接種の前に糞便サンプルを収集します。 急性胃腸感染症では糞便サンプルは採取されません。

微生物叢サンプルからの DNA は、Chemagic 360 マシンおよび Chemagic Stool 200 H96 キット (PerkinElmer、トゥルク、フィンランド) を使用して単離されます。 サンプルは、トゥルク大学病院の臨床微生物学部門で Illumina Nextseq 2000 マシンを使用するか、フィンランド機能ゲノミクスセンターで Illumina Novaseq 6000 マシンを使用して配列決定されます。

マイクロバイオームの結果:

• 16S 次世代シーケンス
• メタゲノム配列決定とコロニー形成の原因
• マイクロバイオーム由来の細胞外小胞: プロテオーム、細菌性 16S
• 微生物叢が生成する代謝物
• 抗菌薬耐性遺伝子

マイクロバイオーム分析には高度なバイオインフォマティクスが使用されます。 以前に報告されたように、メタゲノム配列決定を使用してコロニー形成の原因が決定されます。

2.5 アンケート

家族のライフスタイル、環境への曝露、研究対象の乳児とその親の健康に関するデータは、オンラインアンケートを使用して収集され、データ収集中のモニタリングとデータクエリが可能になります。 アンケートは、乳児の誕生前とその後に両親によって記入されます。 保護者は、生後3ヵ月時と12ヵ月時のお子様の栄養、胃腸機能、世話の仕方などに関するアンケートに記入していただきます。 子どもの成長とともに質問も変わります。 病気、投薬、プロバイオティクスやその他の栄養補助食品の使用がアンケートで報告されます。 栄養、健康、背景に関するアンケートは、進行中の HELMi 研究や Secflor 研究と主に同様です。 アンケートへの回答率の遵守を強化するために、保護者は電子メールおよび SMS メッセージで自動リマインダーを受け取ります。

2.6 患者の記録

周産期データは、新生児の低血糖、血糖値の追跡調査、退院前のブドウ糖点滴静注の必要性、退院時の年齢、感染症の症状、感染パラメータのレベル、入院中の抗生物質の使用に関する電子分娩記録データから取得されます。滞在日数は病院の患者記録から収集されます。 ウェルベイビークリニックへの通常の訪問中に測定された3歳までの成長データとワクチン接種データは、親またはウェルベイビークリニックから収集されます。 3 歳までの抗生物質およびその他の薬剤の使用はアンケートによって収集され、保護者の書面による許可を得て Kanta サービスから確認されます。

2.7 電力解析

スクリーニングプロセスの結果、この地域の妊婦の24%がB群連鎖球菌（GBS）キャリア状態にあり、スクリーニングサンプルにおけるその他の陽性所見により、除外率は40%と予想されます。 この試験は 150 人の母親を計画サンプルとして設計されており、スクリーニング陽性による推定脱落率が 40% である被験者の最終的な数は 90 人 (各介入グループで 30 人) となります。追跡期間中に脱落者がいる。 マイクロバイオーム データは多次元であり、バイナリ結果は検出力分析には適していません。