肥胖母亲的新生儿 - 粪便微生物移植，随机对照试验 (SISU-FMT)

1. 背景

   近几十年来，全球儿童肥胖症患病率急剧上升。 肥胖儿童和青少年成年后肥胖的可能性是不肥胖儿童和青少年的五倍左右。 尽管儿童肥胖是一个复杂且多因素的结果，但肥胖儿童似乎在出生时就已经具有不同的肠道微生物组。 之前的许多研究都强调孕产妇危险因素，例如孕前较高的孕产妇体重指数、妊娠期体重增加过多、妊娠期糖尿病（GDM）和剖腹产是儿童超重或肥胖的危险因素。 围产期因素，特别是剖腹产分娩以及围产期抗生素，也被认为是生命早期微生物群组成和发育的关键决定因素。 然而，其机制尚不清楚。

   据报道，患有肥胖和/或妊娠糖尿病的母亲具有与肥胖相关的肠道微生物群。 微生物群的变化可能会在阴道分娩过程中传染给孩子。 此前，宏基因组测序已成功用于比较婴儿定植的主要来源和肠道微生物群的垂直传播，结果表明>70%的微生物群在阴道分娩过程中从母亲垂直传播给新生儿。

   在芬兰，剖腹产率已从占所有新生儿的 16-17% 上升至 19.6%。 估计的全球平均比率相似，但剖腹产率预计将从目前的 21.1% 增加到 28.5%。 令人着迷的是，剖腹产会在关键的发育窗口期间破坏有益微生物从母亲到婴儿的垂直传播。 除了肥胖的风险之外，剖腹产还会增加患传染病和慢性疾病的风险，例如自身免疫性疾病、哮喘，甚至某些癌症。

   已经提出并测试了不同的治疗方法来恢复婴儿剖腹产中的新生儿微生物群。 肠道微生物和母体肠道菌株在出生后的新生儿肠道微生物群中占最持久的比例，而阴道细菌和母体阴道菌株仅构成一小部分且短暂的部分。 在两项研究中，剖腹产婴儿的粪便微生物群组成成功地恢复了通过阴道播种而中断的肠道拟杆菌菌株的传播，而剖腹产婴儿口服母体阴道微生物群对微生物群组成没有明显影响。 在之前的一项研究中，来自母亲的粪便移植以及已发表的方案已被证明可以成功且安全地改变婴儿肠道微生物群的发育。

   有证据表明，在关键的发育窗口期改变婴儿肠道微生物群是可能的，但这些干预措施的代谢后果和临床意义尚不清楚。 此外，从长远来看，尚不清楚哪种微生物群以及来自谁的微生物群对儿童的健康最有利。

   研究人员推测，肥胖可能是一种垂直传播的疾病，因为新生儿从母亲那里接受了与肥胖相关的微生物群。 此外，定植来源是一个可改变的因素，可以通过使用早期粪便微生物群移植来改变。

2. 研究设计和方法

2.1. 收集和筛查母亲的粪便和阴道样本

助产士和医生在访视时告知潜在参与研究的母亲，研究护士会联系那些有兴趣参与的母亲。 在知情同意后，最迟在预定 CS 前 10-14 天对母亲进行潜在传染病检测，如下所述。 从母亲处采集 100 g 粪便样本和 15 mL 血液样本。 母亲根据书面说明将粪便分入给药样品管中。 使用盖子上的勺子将用于移植的粪便收集到空管中。 母亲通知研究护士，研究护士尽快将用于筛查的管子送到实验室，在那里用新鲜样本准备移植物 - 这一过程在 6 小时内完成。

筛查新鲜粪便样本中是否存在寄生虫、致病病毒和细菌。 使用一份新鲜粪便样品（0.125 克）来测定样品的细菌组成。 如果尚未在孕产妇福利诊所获取阴道样本作为常规随访的一部分，则将在访视期间获取阴道样本以评估分娩方式。

血液检查：全血细胞计数、红细胞沉降率、C反应蛋白、丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、白蛋白、肌酐、HIV、乙型、丙型和戊型肝炎、梅毒螺旋体、人类T细胞白血病病毒、巨细胞病毒和EB病毒

阴道和会阴筛查：B 族链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)、超广谱 β 内酰胺酶 (ESBL)

粪便筛查：沙门氏菌属、志贺氏菌属、大肠杆菌/空肠弯曲杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、肠出血性大肠杆菌 (EHEC)、肠侵袭性大肠杆菌 (EIEC)、产肠毒素大肠杆菌 (ETEC)、弧菌属、志贺邻单胞菌、艰难梭菌、隐孢子虫属、溶组织内阿米巴、兰伯氏贾第虫、诺如病毒、多重耐药革兰氏阴性菌 (MDRGN)、万古霉素耐药肠球菌 (VRE)、单核细胞增生李斯特菌、幽门螺杆菌、Sars-CoV-2。

2.2 粪便微生物移植

来自母亲的新鲜粪便样本的另一部分用作移植物，为此目的，将 1 g 粪便溶解在 15 mL 等渗盐水和 10% 甘油中，均质化，并将移植物的 0.5 mL 等分试样立即冷冻并保存在-80°C。

来自图尔库微生物组生物库（图尔库大学和图尔库大学医院）的正常体重、健康女性捐赠者（18 至 35 岁）的粪便移植。 捐赠者与母亲同时接受潜在传染病检测。

2.3 母婴室随访

在住院期间，从出生后两到三天的第一次粪便中采集粪便样本。 第一次喂养后，新生儿将根据住院病房的医院方案进行随访。 在之前的研究中，接受粪便移植的新生儿很少出现发烧的情况。 可能的不良事件，例如蠕动增加、腹泻、呕吐、发烧和皮疹，都会报告到患者记录的电子数据库中，并由研究人员从那里收集。 出院前，通常会在出生后第二天，对孩子进行称重，并由儿科医生或儿科专业医生进行出院检查。

2日龄时，在筛查SCID和代谢性疾病样本的同时，从足跟抽取的毛细血管血样本（100μl）中分离外周血单核细胞（PBMC），并保存在-140℃。 分离血清并于-80℃保存。 对细胞进行分析，包括单细胞 mRNA 测序以检查基因表达水平，以及通过流式细胞术进行免疫表型分析以检查免疫细胞类型的分布以及功能特性，包括激活和表面受体。 通过高多重 Olink 或其他免疫测定法从血清样本 (10 µl) 中检查炎症、免疫和肥胖相关的血清成分。

2.4 出院后随访

从产后第一周开始，婴儿就按照正常的国家方案在婴儿诊所接受随访。 作为研究的一部分，家长可以联系奥卢大学医院的儿科急诊科。

产后 3 个月和 12 个月时，父母被要求填写一份有关孩子健康的在线调查问卷，收集婴儿和母亲的粪便样本并将其发送到 XXOMNIgeneGUT（DNA genotek，加拿大安大略省）管中进行微生物群分析，并发送到 OMNImetGUT 管中进行微生物群分析。代谢物并暂时储存在室温下，然后通过邮件转移到图尔库微生物组生物库。 如果可能的话，在出生后 3 个月，在第二次口服轮状病毒疫苗接种之前收集粪便样本。 急性胃肠道感染期间不采集粪便样本。

将使用 Chemagic 360 机器和 Chemagic Stool 200 H96 试剂盒（PerkinElmer，图尔库，芬兰）分离微生物样本中的 DNA。 样本将在图尔库大学医院临床微生物学部使用 Illumina Nextseq 2000 机器进行测序，或在芬兰功能基因组中心使用 Illumina Novaseq 6000 机器进行测序。

微生物组结果：

• 16S下一代测序
• 宏基因组测序和定植来源
• 微生物组来源的细胞外囊泡：蛋白质组、细菌 16S
• 微生物群产生的代谢物
• 抗菌素耐药基因

先进的生物信息学将用于微生物组分析。 使用宏基因组测序的定植来源将如先前报道的那样确定。

2.5 问卷调查

通过在线调查问卷收集家庭生活方式、环境暴露以及研究婴儿及其父母的健康状况数据，以便在数据收集过程中进行监测和数据查询。 调查问卷由婴儿出生前和出生后的父母填写。 要求家长填写关于孩子3个月和12个月的营养、胃肠功能和护理习惯的调查问卷。 随着孩子的成长，问题也会发生变化。 调查问卷中报告了疾病、药物治疗以及益生菌和其他膳食补充剂的使用。 与营养、健康和背景相关的调查问卷主要与正在进行的 HELMi 研究和 Secflor 研究相似。 为了提高调查问卷答复率的合规性，家长会通过电子邮件和短信收到自动提醒。

2.6 患者记录

围产期数据将从电子分娩记录数据中获得，包括新生儿低血糖、血糖水平随访、出院前静脉注射葡萄糖的需要、出院时的年龄、感染症状、感染参数水平以及住院期间抗生素的使用情况住院期间，将从医院收集患者记录。 正常就诊健康婴儿诊所期间测量的三岁以下生长数据和疫苗接种数据将从父母或健康婴儿诊所收集。 三岁以下的抗生素和其他药物的使用情况将通过问卷调查收集，并在家长书面许可的情况下由 Kanta 服务确认。

2.7 功耗分析

由于本地区 24% 的孕妇存在 B 族链球菌 (GBS) 携带者以及筛查样本中的其他阳性结果，因此筛查过程预计排除率为 40%。 该试验的计划样本为 150 名母亲，考虑到有可能因筛查呈阳性而导致退出率估计为 40% 的最终受试者人数为 90 人（每个干预组 30 人）。随访期间有中途退出者。 微生物组数据是多维的，二元结果不适合功效分析。