비만 산모의 신생아 - 대변 마이크로바이옴 이식, RCT (SISU-FMT)

1. 배경

   최근 수십 년 동안 전 세계적으로 어린이 비만 유병률이 급격히 증가했습니다. 비만한 어린이와 청소년은 비만이 아닌 어린이와 청소년에 비해 성인이 되어 비만이 될 가능성이 약 5배 더 높습니다. 아동기 비만은 복잡하고 다인적인 결과이지만, 비만 아동은 태어날 때부터 이미 다른 장내 미생물군집을 갖고 있는 것으로 보입니다. 이전의 많은 연구에서는 임신 전 산모의 높은 BMI, 과도한 임신 체중 증가, 임신성 당뇨병(GDM) 및 제왕절개와 같은 산모의 위험 요소를 아동기 과체중 또는 비만의 위험 요소로 강조했습니다. 주산기 요인, 특히 제왕절개로 인한 출산과 주산기 항생제도 초기 미생물군 구성 및 발달의 중요한 결정 요인으로 확인되었습니다. 그러나 메커니즘은 명확하지 않습니다.

   비만 및/또는 임신성 당뇨병이 있는 산모는 비만과 관련된 장내 미생물을 갖고 있는 것으로 보고되었습니다. 미생물총의 변화는 질 분만 중에 아이에게 전달될 수 있습니다. 이전에는 메타지놈 시퀀싱이 유아의 주요 집락 원인과 장내 미생물의 수직 전달을 비교하는 데 성공적으로 사용되었으며, 미생물의 70% 이상이 질 분만 중에 산모에서 신생아에게 수직으로 전달되는 것으로 나타났습니다.

   핀란드에서는 제왕절개 비율이 전체 출생의 16~17%에서 19.6%로 증가했습니다. 글로벌 평균 추정 비율은 비슷하지만 제왕절개 비율은 현재 21.1%에서 28.5%로 높아질 것으로 예상된다. 제왕절개는 중요한 발달 기간 동안 엄마에게서 아기에게로 유익한 미생물이 수직적으로 전달되는 것을 방해한다는 사실이 최면에 걸립니다. 비만의 위험 외에도 제왕절개술은 자가면역 질환, 천식, 일부 암과 같은 감염성 및 만성 질환의 위험을 증가시킵니다.

   유아의 제왕절개에서 신생아 미생물군집 복원을 위해 다양한 치료 접근법이 제안되고 테스트되었습니다. 장내 미생물과 산모의 장내 미생물은 출생 후 신생아 장내 미생물의 가장 지속적인 부분을 차지하는 반면, 질 박테리아와 산모의 질 계통은 작고 일시적인 부분만을 구성합니다. 두 연구에서, 제왕절개로 태어난 유아의 대변 미생물군 구성은 질 파종에 의해 장내 박테로이데스 균주의 파괴된 전염을 회복하는 데 성공했지만, 제왕절개 유아에게 산모의 질 미생물군을 경구 투여하면 미생물군 구성에 눈에 띄는 영향이 없었습니다. 이전 연구에서, 발표된 프로토콜을 통해 엄마의 대변 이식은 유아의 장내 미생물의 발달을 성공적이고 안전하게 수정하는 것으로 나타났습니다.

   중요한 발달 기간 동안 유아의 장내 미생물을 변형시킬 수 있다는 증거가 있으므로 이러한 개입의 대사 결과와 임상적 중요성은 알려져 있지 않습니다. 또한 장기적으로 어떤 종류의 미생물군이 아이의 건강에 가장 좋은지는 알려져 있지 않습니다.

   연구자들은 신생아가 엄마로부터 비만 관련 미생물군을 물려받기 때문에 비만이 수직 전염 질병일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 또한, 집락화의 원인은 수정 가능한 요소이며 초기 대변 미생물군 이식을 사용하여 변경할 수 있습니다.

2. 연구 설계 및 방법

2.1. 산모로부터 분변 및 질 샘플 모집 및 선별

조산사와 의사는 방문 시 잠재적으로 참여하는 어머니에게 연구에 대해 알리고 참여에 관심이 있는 사람들에게는 연구 간호사가 연락합니다. 사전 동의 후 산모는 예정된 CS 전 늦어도 10-14일 전에 아래 설명된 대로 잠재적인 전염성 질병에 대한 검사를 받습니다. 산모로부터 100g의 대변 샘플과 15mL의 혈액 샘플을 채취합니다. 엄마는 서면 지침에 따라 배설물을 투여된 샘플 튜브에 나눕니다. 이식을 위한 대변은 뚜껑에 있는 숟가락을 사용하여 빈 튜브에 수집됩니다. 어머니는 검사를 위해 채취한 튜브를 가능한 한 빨리 실험실로 전달하는 연구 간호사에게 알립니다. 그곳에서 신선한 샘플로 이식이 준비됩니다. 이 과정은 6시간 안에 완료됩니다.

신선한 대변 샘플을 통해 기생충, 병원성 바이러스 및 박테리아가 있는지 검사합니다. 신선한 분변 샘플의 분취량(0.125g)을 사용하여 샘플의 박테리아 구성을 결정합니다. 정기적인 후속 조치의 일환으로 산모 복지 클리닉에서 아직 채취하지 않은 경우 분만 방식 평가를 위해 방문 중에 질 샘플을 채취하게 됩니다.

혈액 검사: 전혈구수, 적혈구 침강 속도, C 반응성 단백질, 알라닌 트랜스아미나제, 알칼리성 포스파타제, 감마-글루타밀 전이효소, 알부민, 크레아티닌, HIV, B형, C형 및 E형 간염, 트레포네마 팔리듐, 인간 T세포 백혈병 바이러스, CMV 및 EBV

질 및 회음부 검사: 그룹 B 연쇄상 구균, 메티실린 내성 황색포도구균(MRSA), 확장 스펙트럼 베타 락타마제(ESBL)

대변 ​​검사: 살모넬라 spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, 장출혈성 대장균(EHEC), 장침습성 대장균(EIEC), Enterotoxigenic E. coli(ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia Lamblia, Norovirus, 다중 약물 내성 그람 음성 박테리아(MDRGN), 반코마이신 내성 장구균(VRE), 리스테리아 모노사이토게네스, 헬리코박터 파일로리, Sars-CoV-2.

2.2 분변 미생물군 이식

산모의 신선한 배설물 샘플의 또 다른 부분을 이식으로 사용하고 이를 위해 배설물 1g을 등장성 식염수 15mL와 10% 글리세롤에 용해시켜 균질화하고 이식된 0.5mL 분취량을 즉시 냉동 보관합니다. -80 °C에서.

투르쿠 마이크로바이옴 바이오뱅크(투르쿠 대학 및 투르쿠 대학 병원)에서 온 정상 체중의 건강한 여성 기증자(18~35세)의 대변 이식. 기증자는 어머니와 동시에 잠재적인 전염병에 대한 검사를 받습니다.

2.3 산모 및 아기 부서에서의 후속 조치

입원 기간 동안, 생후 2~3일에 첫 배변에서 대변 샘플을 채취합니다. 첫 수유 후 신생아는 모자동실 병동의 병원 프로토콜에 따라 추적 관찰됩니다. 이전 연구에서는 대변 이식을 받은 신생아에게서 발열이 거의 보고되지 않았습니다. 연동운동 증가, 설사, 구토, 발열, 발진 등 발생할 수 있는 부작용은 환자 기록의 전자 데이터베이스에 보고되고 연구원들은 그곳에서 수집합니다. 퇴원하기 전에 아이의 체중을 측정하고 일반적으로 출생 후 2일차에 소아과 의사 또는 소아과 전문의가 퇴원 검사를 실시합니다.

생후 2일이 되면 SCID 및 대사질환 검사 샘플과 동시에 발뒤꿈치에서 채취한 모세혈관 혈액 샘플(100μl)에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하여 -140℃에 보관합니다. 혈청을 분리하여 -80℃에 보관합니다. 세포는 유전자 발현 수준을 검사하기 위한 단일 세포 mRNA 염기서열 분석과 면역 세포 유형의 분포뿐만 아니라 활성화 및 표면 수용체를 포함한 기능적 특성을 검사하기 위한 유동 세포 계측법을 통한 면역 표현형 분석을 포함한 분석을 거칩니다. 염증성, 면역성 및 비만 관련 혈청 성분은 혈청 샘플(10μl)에서 고다중 Olink 또는 기타 면역분석법을 통해 검사됩니다.

2.4 퇴원 후 후속조치

출생 후 첫 주부터 정상적인 국가 프로토콜에 따라 아기 건강 클리닉에서 아기를 추적 관찰합니다. 연구의 일환으로 부모는 오울루 대학 병원의 소아 응급실에 연락할 수 있습니다.

출생 후 3개월과 12개월에 부모는 아이의 건강에 관한 온라인 설문지를 작성하고 유아와 산모의 대변 샘플을 수집하여 미생물군 분석을 위해 XXOMNIgeneGUT(DNA genotek, Ontario, Canada) 튜브로 보내고 OMNImetGUT 튜브로 보내어 아기의 건강에 대해 질문합니다. 대사산물을 실온에 임시 보관한 후 우편으로 Turku Microbiome Biobank로 전송합니다. 가능하다면 출생 후 3개월에 두 번째 경구 로타 바이러스 백신 접종 전에 대변 샘플을 채취합니다. 급성 위장관 감염 중에는 대변 샘플을 수집하지 않습니다.

미생물군 샘플의 DNA는 Chemagic 360 기계 및 Chemagic Stool 200 H96 키트(PerkinElmer, Turku, Finland)를 사용하여 분리됩니다. 샘플은 Illumina Nextseq 2000 기계를 사용하는 투르쿠 대학 병원, 임상 미생물학 또는 Illumina Novaseq 6000 기계를 사용하는 핀란드 기능 유전체학 센터에서 시퀀싱됩니다.

미생물 결과:

• 16S 차세대 시퀀싱
• 메타게놈 시퀀싱 및 콜로니화 소스
• 마이크로바이옴 유래 세포밖 소포체: 프로테옴, 세균 16S
• 미생물군이 생산하는 대사산물
• 항균제 내성 유전자

마이크로바이옴 분석에는 첨단 생물정보학이 활용됩니다. 메타게놈 시퀀싱을 사용하여 집락화 소스는 이전에 보고된 대로 결정됩니다.

2.5 설문지

온라인 설문지를 사용하여 가족의 생활 방식, 환경 노출 및 연구 대상 유아와 부모의 건강에 대한 데이터를 수집하고 데이터 수집 중에 모니터링 및 데이터 쿼리를 가능하게 합니다. 설문지는 아기가 태어나기 전과 그 이후에 부모가 작성합니다. 부모는 생후 3개월과 12개월의 아이의 영양, 위장 기능 및 관리 관행에 관한 설문지를 작성해야 합니다. 아이가 성장함에 따라 질문도 달라집니다. 질병, 약물 치료, 프로바이오틱스 및 기타 건강 보조 식품의 사용이 설문지에 보고됩니다. 영양, 건강 및 배경과 관련된 설문지는 현재 진행 중인 HELMi 연구 및 Secflor 연구와 주로 유사합니다. 설문지 응답률을 높이기 위해 부모는 이메일과 SMS 메시지를 통해 자동 알림을 받습니다.

2.6 환자 기록

주산기 데이터는 신생아의 저혈당증, 혈당 수치 추적, 퇴원 전 정맥 내 포도당 주입 필요성, 퇴원 시 연령, 감염 증상, 감염 매개변수 수준 및 병원 중 항생제 사용에 관한 전자 분만 기록 데이터에서 얻습니다. 병원의 환자 기록에서 수집됩니다. 영아한의원 정상 방문 시 측정한 3세까지의 성장 데이터와 영아한의원으로부터 예방접종 데이터를 수집한다. 3세까지의 항생제 및 기타 약물 사용은 설문지를 통해 수집되며 부모의 서면 허가를 받아 Kanta-service에서 확인됩니다.

2.7 전력 분석

선별 과정 결과, 우리 지역 임산부의 24%가 그룹 B 연쇄상 구균(GBS) 보균자 상태이고 선별 샘플에서 기타 긍정적인 결과가 나왔기 때문에 40%의 배제율이 예상됩니다. 이 시험은 150명의 어머니를 대상으로 계획된 표본으로 설계되었으며, 선별검사 양성으로 인해 약 40%의 탈락률을 보이는 대상의 최종 수는 90명(각 개입 그룹당 30명)이 될 가능성이 높습니다. 후속 기간 동안 탈락자가 있습니다. 미생물군집 데이터는 다차원적이며 이진 결과는 검정력 분석에 적합하지 않습니다.