Noworodek matki chorej na otyłość – przeszczep mikrobiomu kałowego, RCT (SISU-FMT)

1. TŁO

   W ostatnich dziesięcioleciach częstość występowania otyłości u dzieci na całym świecie dramatycznie wzrosła. Otyłe dzieci i młodzież są około pięć razy bardziej narażone na otyłość w wieku dorosłym niż dzieci, które nie są otyłe. Chociaż otyłość u dzieci jest zjawiskiem złożonym i wieloczynnikowym, wydaje się, że otyłe dzieci mają inny mikrobiom jelitowy już od urodzenia. Wiele z poprzednich badań podkreślało czynniki ryzyka matki, takie jak wyższy BMI matki przed ciążą, nadmierny przyrost masy ciała w czasie ciąży, cukrzyca ciążowa (GDM) i cesarskie cięcie jako czynnik ryzyka nadwagi lub otyłości u dzieci. Czynniki okołoporodowe, w szczególności poród przez cesarskie cięcie, a także antybiotyki okołoporodowe, również zostały zidentyfikowane jako krytyczne determinanty składu i rozwoju mikroflory we wczesnym okresie życia. Jednak mechanizmy nie są jasne.

   Donoszono, że u matek z otyłością i/lub cukrzycą ciążową występuje mikroflora jelitowa związana z otyłością. Zmiany w mikroflorze mogą zostać przeniesione na dziecko podczas porodu drogą pochwową. Wcześniej sekwencjonowanie metagenomu było z powodzeniem stosowane do porównywania głównego źródła kolonizacji u niemowląt z wertykalnym przenoszeniem mikroflory jelitowej i wykazało, że ponad 70% mikroflory jest przenoszone pionowo z matki na noworodka podczas porodu drogą pochwową.

   W Finlandii odsetek cesarskich cięć wzrósł z 16–17% do 19,6% wszystkich urodzeń. Szacowane średnie światowe wskaźniki są podobne, ale oczekuje się, że wskaźnik cięcia cesarskiego wzrośnie z obecnych 21,1% do 28,5%. Zahipnotyzowane jest to, że cesarskie cięcie zakłóca pionowe przenoszenie pożytecznych drobnoustrojów z matki na dziecko w krytycznym oknie rozwojowym. Oprócz ryzyka otyłości, cesarskie cięcie zwiększa ryzyko chorób zakaźnych i przewlekłych, takich jak choroby autoimmunologiczne, astma, a nawet niektóre nowotwory.

   Zaproponowano i przetestowano różne podejścia terapeutyczne w celu przywrócenia mikrobiomu noworodków w cięciu cesarskim u niemowląt. Drobnoustroje jelitowe i szczepy jelitowe matki stanowią najbardziej trwałą część mikroflory jelitowej noworodka po urodzeniu, podczas gdy bakterie pochwowe i szczepy pochwowe matki stanowią jedynie niewielką i przejściową część. W dwóch badaniach wykazano, że skład mikroflory kałowej u niemowląt urodzonych przez cesarskie cięcie pozwolił na przywrócenie przerwanego przenoszenia jelitowych szczepów Bacteroides przez posiew dopochwowy, podczas gdy doustne podawanie matczynej mikroflory pochwowej niemowlętom urodzonym przez cesarskie cięcie nie miało zauważalnego wpływu na skład mikroflory. W poprzednim badaniu wykazano, że przeszczep kału od matki, zgodnie z opublikowanym protokołem, skutecznie i bezpiecznie modyfikuje rozwój mikroflory jelitowej niemowląt.

   Ponieważ istnieją dowody na to, że możliwa jest modyfikacja mikroflory jelitowej niemowlęcia w krytycznym oknie rozwojowym, konsekwencje metaboliczne i znaczenie kliniczne tych interwencji są nieznane. Poza tym nie wiadomo, jaki rodzaj mikroflory i od kogo będzie najlepszy dla zdrowia dziecka w dłuższej perspektywie.

   Badacze stawiają hipotezę, że otyłość może być chorobą przenoszoną wertykalnie, ponieważ noworodek otrzymuje od matki mikroflorę związaną z otyłością. Co więcej, źródło kolonizacji jest czynnikiem modyfikowalnym i można je zmienić, stosując wczesny przeszczep mikroflory kałowej.

2. PROJEKT I METODY BADANIA

2.1. Pobieranie i badanie próbek kału i pochwy od matki

Położne i lekarze informują potencjalnie uczestniczące matki o badaniu podczas wizyty, a z zainteresowanymi udziałem kontaktuje się pielęgniarka badawcza. Po uzyskaniu świadomej zgody matki poddaje się badaniu pod kątem potencjalnych chorób zakaźnych, jak wyjaśniono poniżej, najpóźniej 10–14 dni przed planowanym CS. Od matki pobiera się próbkę kału o masie 100 g i próbkę krwi o objętości 15 ml. Matka dzieli kał do podanych probówek zgodnie z pisemnymi instrukcjami. Kał do przeszczepu zbiera się do pustej probówki za pomocą łyżki w nakrętce. Matka informuje o tym pielęgniarkę badawczą, która jak najszybciej dostarcza probówki pobrane do badań do laboratorium, gdzie ze świeżej próbki przygotowywany jest przeszczep – proces ten trwa 6 godzin.

Próbkę świeżego kału poddaje się badaniu przesiewowemu na obecność pasożytów oraz chorobotwórczych wirusów i bakterii. Porcję (0,125 g) świeżej próbki kału stosuje się do określenia składu bakteryjnego próbki. Próbki z pochwy zostaną pobrane podczas wizyty w celu oceny sposobu porodu, jeśli nie zostały jeszcze pobrane w poradni opieki położniczej w ramach rutynowej kontroli.

Badania krwi: pełna morfologia krwi, szybkość sedymentacji erytrocytów, białko C-reaktywne, transaminaza alaninowa, fosfataza alkaliczna, transferaza gamma-glutamylowa, albuminy, kreatynina, HIV, wirusowe zapalenie wątroby typu B, C i E, krętek blady, ludzki wirus białaczki T-komórkowej, CMV i EBV

Badania przesiewowe pochwy i krocza: Streptococcus grupy B, Staphylococcus aureus oporny na metycylinę (MRSA), Beta-laktamaza o rozszerzonym spektrum (ESBL)

Badania przesiewowe w kale: Salmonella spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, Enterohemorragic E. coli (EHEC), Enteroinwazyjna E. coli (EIEC), Enterotoksyczna E. coli (ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Norowirus, wielolekooporne bakterie Gram-ujemne (MDRGN), Enterococcus oporny na wankomycynę (VRE), Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Sars-CoV-2.

2.2 Przeszczep mikroflory kałowej

Do przeszczepu wykorzystuje się kolejną część świeżego kału od matki i w tym celu 1 g kału rozpuszcza się w 15 ml izotonicznego roztworu soli i 10% gliceryny, homogenizuje, a 0,5 ml próbki przeszczepu natychmiast zamraża i przechowuje w temperaturze -80°C.

Przeszczep kału od zdrowej dawczyni (18 do 35 lat) z Turku Microbiome Biobank (Uniwersytet w Turku i Szpital Uniwersytecki w Turku). Dawca jest badany pod kątem potencjalnych chorób zakaźnych jednocześnie z matką.

2.3 Kontrola na oddziale matki i dziecka

Podczas pobytu w szpitalu pobiera się próbki kału z pierwszego stolca życia oraz w wieku od dwóch do trzech dni. Po pierwszym karmieniu noworodek podlega kontroli zgodnie z protokołami szpitalnymi na oddziale rooming-in. W poprzednich badaniach rzadko zgłaszano gorączkę u noworodków po przeszczepieniu kału. Możliwe zdarzenia niepożądane, takie jak zwiększona perystaltyka, biegunka, wymioty, gorączka i wysypka, są zgłaszane do elektronicznej bazy danych pacjentów i stamtąd gromadzone przez badaczy. Przed wypisem dziecko jest ważone, a badanie wypisowe przeprowadza pediatra lub lekarz specjalizujący się w pediatrii, zazwyczaj w 2. dobie po porodzie.

W wieku 2 dni, jednocześnie z próbkami do badań przesiewowych w kierunku SCID i chorób metabolicznych, z próbek krwi włośniczkowej (100 µl) pobranych z pięty i przechowywanych w temperaturze -140°C izoluje się komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC). Surowicę oddziela się i przechowuje w temperaturze -80 ℃. Komórki poddaje się analizom, obejmującym sekwencjonowanie mRNA pojedynczych komórek w celu zbadania poziomów ekspresji genów oraz immunofenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej w celu zbadania rozmieszczenia typów komórek odpornościowych, a także właściwości funkcjonalnych, w tym aktywacji i receptorów powierzchniowych. Składniki surowicy związane ze stanem zapalnym, odpornością i otyłością bada się z próbek surowicy (10 µl) za pomocą wysokomultipleksowego testu Olink lub innych testów immunologicznych.

2.4 Dalsze postępowanie po wypisaniu ze szpitala

Od pierwszego tygodnia po porodzie niemowlę znajduje się pod opieką kliniki zdrowego dziecka zgodnie z normalnymi protokołami krajowymi. W ramach badania rodzice mogą skontaktować się z oddziałem ratunkowym pediatrycznym szpitala uniwersyteckiego w Oulu.

W 3 i 12 miesiącu po urodzeniu rodzice proszeni są o wypełnienie kwestionariusza internetowego dotyczącego stanu zdrowia dziecka oraz pobranie i przesłanie próbek kału niemowlęcia i matki do probówek XXOMNIgeneGUT (DNA genotek, Ontario, Kanada) w celu analizy mikrobioty oraz do probówek OMNImetGUT w celu metabolity i tymczasowo przechowywane w temperaturze pokojowej przed przesłaniem pocztą do Turku Microbiome Biobank. 3 miesiące po urodzeniu, jeśli to możliwe, przed drugim doustnym szczepieniem przeciwko wirusowi rota pobiera się próbkę kału. Podczas ostrej infekcji przewodu pokarmowego nie pobiera się próbek kału.

DNA z próbek mikrobioty zostanie wyizolowane przy użyciu maszyn Chemagic 360 i zestawu Chemagic Stool 200 H96 (PerkinElmer, Turku, Finlandia). Próbki zostaną zsekwencjonowane w Szpitalu Uniwersyteckim w Turku, w dziale Mikrobiologii Klinicznej na urządzeniu Illumina Nextseq 2000 lub w Fińskim Centrum Genomiki Funkcjonalnej na urządzeniu Illumina Novaseq 6000.

Wyniki mikrobiomu:

• Sekwencjonowanie kolejnych generacji 16S
• Sekwencjonowanie metagenomu i źródła kolonizacji
• Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe pochodzące z mikrobiomu: proteom, bakteryjny 16S
• Metabolity wytwarzane przez mikrobiotę
• Geny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Do analizy mikrobiomu zostanie wykorzystana zaawansowana bioinformatyka. Źródło kolonizacji za pomocą sekwencjonowania metagenomu zostanie określone, jak podano wcześniej.

2.5 Kwestionariusze

Dane dotyczące stylu życia rodzin, narażenia środowiskowego oraz stanu zdrowia niemowląt i ich rodziców zbierane są za pomocą kwestionariuszy internetowych, co umożliwia monitorowanie i przeglądanie danych podczas gromadzenia danych. Ankiety wypełniają rodzice przed urodzeniem dziecka i później. Rodzice proszeni są o wypełnienie ankiet dotyczących żywienia dziecka, funkcjonowania przewodu pokarmowego oraz praktyk pielęgnacyjnych w 3. i 12. miesiącu życia dziecka. Pytania zmieniają się wraz z rozwojem dziecka. W ankietach podawane są informacje na temat chorób, przyjmowanych leków oraz stosowania probiotyków i innych suplementów diety. Kwestionariusze dotyczące odżywiania, zdrowia i pochodzenia są w większości podobne jak w trwającym badaniu HELMi i Secflor. Aby zwiększyć zgodność wskaźników odpowiedzi na kwestionariusz, rodzice otrzymują automatyczne przypomnienia za pośrednictwem poczty elektronicznej i wiadomości SMS.

2.6 Dokumentacja pacjenta

Dane okołoporodowe będą pozyskiwane z danych z elektronicznego zapisu porodu, dotyczących hipoglikemii noworodka, kontroli poziomu glukozy, konieczności dożylnego wlewu glukozy przed wypisem ze szpitala, wieku w chwili wypisu, objawów zakażenia, poziomu parametrów zakażenia oraz stosowania antybiotyków w szpitalu. pobytu, będą pobierane z kart pacjenta szpitali. Dane o wzroście do trzeciego roku życia mierzone podczas normalnych wizyt w przychodni dobrego dziecka oraz dane dotyczące szczepień będą zbierane od rodziców lub z przychodni zdrowego dziecka. Stosowanie antybiotyków i innych leków do trzeciego roku życia będzie zbierane za pomocą kwestionariuszy i potwierdzane przez Kanta-service za pisemną zgodą rodziców.

2.7 Analiza mocy

W wyniku procesu badań przesiewowych oczekuje się 40% wykluczenia z powodu nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u 24% kobiet w ciąży w naszym regionie oraz innych pozytywnych wyników w próbkach przesiewowych. Badanie zaprojektowano na planowanej próbie 150 matek, co pozwala, aby ostateczna liczba pacjentek, u których odsetek osób przedwcześnie przerywających naukę z powodu pozytywnego wyniku badań przesiewowych wyniosła 90 (30 w każdej grupie interwencyjnej), biorąc pod uwagę, że prawdopodobnie w okresie obserwacji następuje rezygnacja z zajęć. Dane dotyczące mikrobiomu są wielowymiarowe, a wyniki binarne nie nadają się do analizy mocy.