Neonato di madre con obesità - Trapianto di microbioma fecale, RCT (NEMO-FMT)

1. SFONDO

   Negli ultimi decenni, la prevalenza dell’obesità tra i bambini è aumentata drammaticamente in tutto il mondo. I bambini e gli adolescenti obesi hanno circa cinque volte più probabilità di diventare obesi in età adulta rispetto a quelli che non lo sono. Sebbene l’obesità infantile sia un risultato complesso e multifattoriale, sembra che i bambini obesi abbiano un microbioma intestinale diverso già alla nascita. Molti degli studi precedenti evidenziano fattori di rischio materni come un BMI materno più elevato prima della gravidanza, un aumento eccessivo di peso gestazionale, il diabete gestazionale (GDM) e il taglio cesareo come fattori di rischio per il sovrappeso o l’obesità infantile. Anche i fattori perinatali, in particolare il parto mediante taglio cesareo e gli antibiotici perinatali, sono stati identificati come determinanti critici della composizione e dello sviluppo del microbiota nelle prime fasi della vita. I meccanismi però non sono chiari.

   È stato segnalato che le madri con obesità e/o diabete gestazionale hanno un microbiota intestinale associato all’obesità. I cambiamenti nel microbiota potrebbero essere trasmessi al bambino durante il parto vaginale. In precedenza, il sequenziamento del metagenoma è stato utilizzato con successo per confrontare la principale fonte di colonizzazione nei neonati e la trasmissione verticale del microbiota intestinale e ha dimostrato che >70% del microbiota viene trasmesso verticalmente dalla madre al neonato durante il parto vaginale.

   In Finlandia, il tasso di cesarei è aumentato dal 16-17% al 19,6% di tutte le nascite. I tassi medi globali stimati sono simili, ma si prevede che il tasso di cesarei aumenterà dall’attuale 21,1% al 28,5%. È ipnotizzato il fatto che il taglio cesareo interrompa la trasmissione verticale di microbi benefici dalla madre al bambino durante una finestra critica di sviluppo. Oltre al rischio di obesità, il taglio cesareo aumenta il rischio di malattie infettive e croniche come malattie autoimmuni, asma e persino alcuni tumori.

   Sono stati proposti e testati diversi approcci terapeutici per il ripristino del microbioma neonatale nel taglio cesareo nei neonati. I microbi intestinali e i ceppi intestinali materni contribuiscono alla percentuale più persistente del microbiota intestinale neonatale dopo la nascita, mentre i batteri vaginali e i ceppi vaginali materni costituiscono solo una frazione piccola e transitoria. In due studi, le composizioni del microbiota fecale nei neonati nati con taglio cesareo sono riuscite a ripristinare la trasmissione interrotta dei ceppi intestinali di Bacteroides mediante semina vaginale, mentre la somministrazione orale del microbiota vaginale materno ai neonati con taglio cesareo non ha avuto effetti evidenti sulla composizione del microbiota. In uno studio precedente, il trapianto fecale dalla madre, con un protocollo pubblicato, ha dimostrato di modificare con successo e sicurezza lo sviluppo del microbiota intestinale dei neonati.

   Poiché esistono prove che è possibile modificare il microbiota intestinale dei neonati durante una finestra critica di sviluppo, le conseguenze metaboliche e il significato clinico di questi interventi sono sconosciuti. Inoltre, non è noto quale tipo di microbiota e da chi sarebbe il migliore per la salute del bambino a lungo termine.

   I ricercatori ipotizzano che l’obesità possa essere una malattia trasmessa verticalmente poiché un neonato riceve il microbiota correlato all’obesità dalla madre. Inoltre, la fonte della colonizzazione è un fattore modificabile e può essere cambiata utilizzando un trapianto precoce di microbiota fecale.

2. DISEGNO E METODI DI STUDIO

2.1. Reclutamento e screening di campioni fecali e vaginali della madre

Le ostetriche e i medici informano le madri potenzialmente partecipanti dello studio durante la visita e coloro che sono interessati a partecipare vengono contattati dall'infermiera dello studio. Dopo il consenso informato, le madri vengono sottoposte a test per potenziali malattie contagiose come spiegato di seguito, al più tardi 10-14 giorni prima del TC programmato. Dalla madre vengono raccolti un campione fecale di 100 ge un campione di sangue di 15 mL. La madre divide le feci nelle provette dei campioni somministrate secondo le istruzioni scritte. Le feci per il trapianto vengono raccolte in una provetta vuota utilizzando un cucchiaio nel tappo. La madre informa l'infermiera ricercatrice, che consegna il prima possibile le provette prelevate per lo screening al laboratorio, dove viene preparato il trapianto dal campione fresco: questo processo viene completato in un periodo di 6 ore.

Il campione fecale fresco viene sottoposto a screening per la presenza di parassiti, virus e batteri patogeni. Un'aliquota (0,125 g) del campione fecale fresco viene utilizzata per determinare la composizione batterica del campione. I campioni vaginali verranno prelevati durante una visita per la valutazione delle modalità del parto se non già ottenuti presso la clinica per il benessere materno come parte del follow-up di routine.

Esami del sangue: emocromo completo, velocità di eritrosedimentazione, proteina C-reattiva, alanina transaminasi, fosfatasi alcalina, gamma-glutamil transferasi, albumina, creatinina, HIV, epatite B, C ed E, Treponema pallidum, virus della leucemia umana a cellule T, CMV e EBV

Screening vaginale e perineale: streptococco di gruppo B, stafilococco aureo resistente alla meticillina (MRSA), beta lattamasi a spettro esteso (ESBL)

Screening fecale: Salmonella spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, E. coli enteroemorragico (EHEC), E. coli enteroinvasivo (EIEC), E. coli enterotossigenico (ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Norovirus, Batteri gram negativi multiresistenti (MDRGN), Enterococco resistente alla vancomicina (VRE), Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Sars-CoV-2.

2.2 Trapianto di microbiota fecale

Un'altra parte del campione fecale fresco della madre viene utilizzata come trapianto e a tale scopo 1 g di feci viene sciolto in 15 mL di soluzione salina isotonica e glicerolo al 10%, omogeneizzato, e le aliquote da 0,5 mL del trapianto vengono immediatamente congelate e conservate a -80°C.

Trapianto fecale da donatrice sana e di peso normale (dai 18 ai 35 anni) della Turku Microbiome Biobank (Università di Turku e Ospedale universitario di Turku). La donatrice viene testata per potenziali malattie contagiose contemporaneamente alla madre.

2.3 Follow-up nell'unità madre-bambino

Durante la degenza ospedaliera, vengono raccolti campioni fecali dalle prime feci della vita e all'età di due o tre giorni. Dopo la prima poppata il neonato viene seguito secondo i protocolli ospedalieri presso il reparto di rooming-in. In studi precedenti la febbre è stata segnalata raramente nei neonati sottoposti a trapianto fecale. Possibili eventi avversi, come aumento della peristalsi, diarrea, vomito, febbre ed eruzioni cutanee, vengono segnalati nel database elettronico delle cartelle cliniche dei pazienti e da lì raccolti dai ricercatori. Prima della dimissione, il bambino viene pesato e l'esame di dimissione viene eseguito da un pediatra o da un medico specializzato in pediatria, in genere il secondo giorno postnatale.

All'età di 2 giorni, contemporaneamente ai campioni di screening per SCID e malattie metaboliche, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono isolate da campioni di sangue capillare (100 µl) prelevati dal tallone e conservati a -140 ℃. Il siero viene separato e conservato a -80 ℃. Le cellule vengono sottoposte ad analisi, compreso il sequenziamento dell'mRNA di singole cellule per esaminare i livelli di espressione genica e l'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso per esaminare la distribuzione dei tipi di cellule immunitarie nonché le proprietà funzionali, inclusa l'attivazione e i recettori di superficie. I componenti sierici correlati all'infiammazione, all'immunità e all'obesità vengono esaminati da campioni di siero (10 µl) mediante Olink high-multiplex o altri test immunologici.

2.4 Follow-up dopo la dimissione

Dalla prima settimana postnatale il neonato viene seguito nel well-baby clinic secondo i normali protocolli nazionali. Nell'ambito dello studio, i genitori possono essere in contatto con il pronto soccorso pediatrico dell'ospedale universitario di Oulu.

A 3 e 12 mesi dalla nascita, ai genitori viene chiesto di compilare un questionario online sulla salute del bambino e di raccogliere e inviare i campioni fecali del neonato e della madre alle provette XXOMNIgeneGUT (DNA genotek, Ontario, Canada) per l'analisi del microbiota e alle provette OMNImetGUT per metaboliti e conservati temporaneamente a temperatura ambiente prima del trasferimento alla Turku Microbiome Biobank tramite posta. A 3 mesi dalla nascita, il campione fecale viene raccolto prima della seconda vaccinazione contro il virus del rota somministrata per via orale, se possibile. I campioni fecali non vengono raccolti durante l'infezione gastrointestinale acuta.

Il DNA dai campioni di microbiota sarà isolato utilizzando macchine Chemagic 360 e il kit Chemagic Stool 200 H96 (PerkinElmer, Turku, Finlandia). I campioni verranno sequenziati presso l'Ospedale universitario di Turku, Microbiologia clinica su una macchina Illumina Nextseq 2000 o presso il Centro finlandese di genomica funzionale su una macchina Illumina Novaseq 6000.

Risultati del microbioma:

• Sequenziamento delle prossime generazioni 16S
• Sequenziamento del metagenoma e fonte di colonizzazione
• Vescicole extracellulari derivate dal microbioma: proteoma, 16S batterico
• Il microbiota ha prodotto metaboliti
• Geni della resistenza antimicrobica

Per l'analisi del microbioma verrà utilizzata la bioinformatica avanzata. La fonte della colonizzazione utilizzando il sequenziamento del metagenoma sarà determinata come riportato in precedenza.

2.5 Questionari

I dati vengono raccolti sullo stile di vita delle famiglie, sulle esposizioni ambientali e sulla salute dei bambini studiati e dei loro genitori utilizzando questionari online, consentendo il monitoraggio e l'interrogazione dei dati durante la raccolta dei dati. I questionari vengono compilati dai genitori prima della nascita del bambino e successivamente. Ai genitori viene richiesto di compilare questionari sulla nutrizione del bambino, sulla funzione gastrointestinale e sulle pratiche di cura nei 3 mesi e nei 12 mesi di età. Le domande cambiano man mano che il bambino cresce. Nei questionari vengono riportate malattie, farmaci e uso di probiotici e altri integratori alimentari. I questionari relativi all’alimentazione, alla salute e al background sono per lo più simili a quelli dello studio HELMi in corso e dello studio Secflor. Per migliorare la conformità dei tassi di risposta al questionario, i genitori ricevono promemoria automatici tramite e-mail e messaggi SMS.

2.6 Cartelle cliniche dei pazienti

I dati perinatali saranno ottenuti dai dati della cartella clinica elettronica del parto riguardanti l'ipoglicemia del neonato, il follow-up dei livelli di glucosio, la necessità di infusione endovenosa di glucosio prima della dimissione dall'ospedale, l'età alla dimissione, i sintomi dell'infezione, i livelli dei parametri dell'infezione e l'uso di antibiotici durante l'ospedale. soggiorno, verranno raccolti dalle cartelle cliniche dei pazienti ospedalieri. I dati sulla crescita fino all'età di tre anni misurati durante le normali visite alle cliniche Well-Baby e i dati sulle vaccinazioni saranno raccolti dai genitori o dalle cliniche Well-Baby. L'uso di antibiotici e altri farmaci fino all'età di tre anni verrà raccolto tramite questionari e confermato dal Kanta-service con il permesso scritto dei genitori.

2.7 Analisi della potenza

Come risultato del processo di screening, è previsto un tasso di esclusione del 40% a causa dello stato di portatore di streptococchi di gruppo B (GBS) nel 24% delle donne incinte nella nostra regione e di altri risultati positivi nei campioni di screening. Lo studio è stato progettato con un campione pianificato di 150 madri, consentendo che il numero finale di soggetti con un tasso di abbandono stimato del 40% a causa della positività allo screening sia pari a 90 (30 in ciascun gruppo di intervento), tenendo in considerazione che è probabile che presentano abbandoni durante il periodo di follow-up. I dati del microbioma sono multidimensionali e i risultati binari non sono adatti per l’analisi della potenza.