Lihalihavan äidin vastasyntynyt lapsi - Ulosteen mikrobiomisiirto, RCT (NEMO-FMT)

1. TAUSTA

   Viime vuosikymmeninä lasten liikalihavuuden esiintyvyys on lisääntynyt dramaattisesti maailmanlaajuisesti. Lihavat lapset ja nuoret ovat noin viisi kertaa todennäköisemmin lihavia aikuisiässä kuin ne, jotka eivät ole lihavia. Vaikka lasten liikalihavuus on monimutkainen ja monitekijäinen seuraus, näyttää siltä, ​​​​että lihavilla lapsilla on erilainen suoliston mikrobiomi jo syntyessään. Monet aiemmista tutkimuksista korostavat äidin riskitekijöitä, kuten korkeampi äidin painoindeksi ennen raskautta, liiallinen raskauspainon nousu, raskausdiabetes (GDM) ja C-leikkaus lasten ylipainon tai liikalihavuuden riskitekijänä. Perinataaliset tekijät, erityisesti syntymä keisarileikkauksella sekä perinataaliset antibiootit, on myös tunnistettu kriittisiksi tekijöiksi varhaisen elämän mikrobiotan koostumuksessa ja kehityksessä. Mekanismit eivät kuitenkaan ole selvät.

   Äideillä, joilla on liikalihavuus ja/tai raskausdiabetes, on raportoitu olevan liikalihavuuteen liittyvää suoliston mikrobiota. Muutokset mikrobiotassa voivat tarttua lapseen emättimen synnytyksen aikana. Aikaisemmin metagenomisekvensointia on käytetty menestyksekkäästi verrattaessa imeväisten pääasiallista kolonisaation lähdettä ja suoliston mikrobiotan vertikaalista siirtymistä ja osoitettu, että > 70 % mikrobiotosta siirtyy vertikaalisesti äidiltä vastasyntyneelle emättimen synnytyksen aikana.

   Suomessa C-leikkausaste on noussut 16-17 prosentista 19,6 prosenttiin kaikista syntyneistä. Arvioidut globaalit keskiarvot ovat samanlaiset, mutta C-osion koron odotetaan nousevan nykyisestä 21,1 prosentista 28,5 prosenttiin. On hypnotisoitu, että C-leikkaus häiritsee hyödyllisten mikrobien pystysuoraa siirtymistä äidiltä lapselle kriittisen kehitysikkunan aikana. Lihavuusriskin lisäksi C-leikkaus lisää riskiä sairastua tarttuviin ja kroonisiin sairauksiin, kuten autoimmuunisairauksiin, astmaan ja jopa joihinkin syöpiin.

   Erilaisia ​​terapeuttisia lähestymistapoja on ehdotettu ja testattu vastasyntyneen mikrobiomin palauttamiseksi imeväisten C-osassa. Suolistomikrobit ja äidin suolistokannat muodostavat pysyvimmän osan vastasyntyneen suoliston mikrobiosta syntymän jälkeen, kun taas emättimen bakteerit ja äidin emättimen kannat muodostavat vain pienen ja ohimenevän osan. Kahdessa tutkimuksessa ulosteen mikrobiotakoostumukset C-leikkauksen kautta syntyneillä vauvoilla ovat onnistuneet palauttamaan suolen Bacteroides-kantojen häiriytyneen siirron emättimen kylvössä, kun taas äidin emättimen mikrobiotan oraalisella antamisella C-leikkauksen vauvoille ei ollut havaittavaa vaikutusta mikrobiotan koostumukseen. Aiemmassa tutkimuksessa äidin ulosteensiirron julkaistulla protokollalla on osoitettu muuntavan imeväisten suoliston mikrobiotan kehitystä onnistuneesti ja turvallisesti.

   Koska on näyttöä siitä, että imeväisten suoliston mikrobiota on mahdollista muuttaa kriittisen kehitysikkunan aikana, näiden interventioiden metabolisia seurauksia ja kliinistä merkitystä ei tunneta. Lisäksi ei tiedetä, millainen mikrobiota ja keneltä olisi lapsen terveydelle pitkällä aikavälillä parasta.

   Tutkijat olettavat, että liikalihavuus voi olla vertikaalisesti leviävä sairaus, koska vastasyntynyt lapsi saa lihavuuteen liittyvää mikrobiota äidiltään. Lisäksi kolonisaation lähde on muunnettavissa oleva tekijä, ja sitä voidaan muuttaa käyttämällä varhaista ulosteen mikrobiotasiirtoa.

2. TUTKIMUKSEN SUUNNITTELU JA MENETELMÄT

2.1. Uloste- ja emätinnäytteiden rekrytointi ja seulonta äidiltä

Kätilöt ja lääkärit tiedottavat mahdollisille osallistuville äideille tutkimuksesta käynnillä ja osallistumisesta kiinnostuneisiin ottaa yhteyttä tutkimussairaanhoitaja. Tietoisen suostumuksen jälkeen äidit testataan mahdollisten tarttuvien tautien varalta, kuten alla on selitetty, viimeistään 10-14 päivää ennen suunniteltua CS. Äidiltä otetaan 100 g ulostenäyte ja 15 ml verinäyte. Äiti jakaa ulosteet annettuihin näyteputkiin kirjallisten ohjeiden mukaan. Ulosteet siirrettä varten kerätään tyhjään putkeen korkissa olevan lusikan avulla. Äiti ilmoittaa asiasta tutkimussairaanhoitajalle, joka toimittaa seulontaan otetut putket mahdollisimman pian laboratorioon, jossa tuoreesta näytteestä valmistetaan siirto - tämä prosessi päättyy 6 tunnin aikavälillä.

Tuoreesta ulostenäytteestä seulotaan loisten ja patogeenisten virusten ja bakteerien esiintyminen. Alikvoottia (0,125 g) tuoreesta ulostenäytteestä käytetään näytteen bakteerikoostumuksen määrittämiseen. Emätinnäytteet otetaan käynnin aikana synnytystavan arvioimiseksi, jos niitä ei ole jo otettu äitiysneuvolasta osana rutiiniseurantaa.

Verikokeet: täydellinen verenkuva, punasolujen sedimentaationopeus, C-reaktiivinen proteiini, alaniinitransaminaasi, alkalinen fosfataasi, gammaglutamyylitransferaasi, albumiini, kreatiniini, HIV, B-, C- ja E-hepatiitti, Treponema pallidum, ihmisen T-soluleukemiavirus, CMV ja EBV

Emättimen ja välikalvon seulonta: B-ryhmän streptokokki, metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus (MRSA), laajennettu beetalaktamaasi (ESBL)

Ulosteen seulonta: Salmonella spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, Enterohemorragic E. coli (EHEC), Enteroinvasiivinen E. coli (EIEC), Enterotoksigeeninen E. coli (ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, norovirus, monilääkeresistentit gramnegatiiviset bakteerit (MDRGN), vankomysiiniresistentit enterococcus (VRE), Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Sars-CoV-2.

2.2 Ulosteen mikrobiotan siirto

Toinen osa äidin tuoreesta ulostenäytteestä käytetään siirteenä ja tätä tarkoitusta varten 1 g ulostetta liuotetaan 15 ml:aan isotonista suolaliuosta ja 10-prosenttista glyserolia, homogenoidaan ja 0,5 ml:n alikvootit siirrettä pakastetaan ja varastoidaan välittömästi. -80 °C:ssa.

Ulosteensiirto normaalipainoiselta terveeltä naisluovuttajalta (18-35 vuotta) Turun Microbiome Biopankista (Turun yliopisto ja Turun yliopistollinen sairaala). Luovuttaja testataan mahdollisten tartuntatautien varalta samanaikaisesti äidin kanssa.

2.3 Seuranta äidin ja vauvan yksikössä

Sairaalahoidon aikana ulostenäytteet otetaan elämän ensimmäisestä ulosteesta ja 2-3 päivän iässä. Ensimmäisen ruokinnan jälkeen vastasyntynyttä seurataan huoneosastolla sairaalan protokollien mukaisesti. Aiemmissa tutkimuksissa kuumetta on raportoitu harvoin vastasyntyneillä, joille on tehty ulosteensiirto. Mahdolliset haittatapahtumat, kuten lisääntynyt peristaltiikka, ripuli, oksentelu, kuume ja ihottuma, raportoidaan sähköiseen potilastietotietokantaan, ja tutkijat keräävät ne sieltä. Ennen kotiutumista lapsi punnitaan ja kotiutustutkimuksen suorittaa lastenlääkäri tai lastentautiin erikoistunut lääkäri, tyypillisesti synnytyksen jälkeisenä päivänä 2.

2 päivän iässä, samanaikaisesti SCID- ja aineenvaihduntasairauksien seulontanäytteiden kanssa, perifeerisen veren mononukleaarisolut (PBMC) eristetään kantapäästä otetuista kapillaariverinäytteistä (100 µl) ja säilytetään -140 ℃:ssa. Seerumi erotetaan ja säilytetään -80 ℃:ssa. Soluille tehdään analyysejä, mukaan lukien yhden solun mRNA-sekvensointi geenin ilmentymistasojen tutkimiseksi ja immunofenotyypitys virtaussytometrialla immuunisolutyyppien jakautumisen sekä toiminnallisten ominaisuuksien, mukaan lukien aktivaatio- ja pintareseptorien, tutkimiseksi. Tulehdukselliset, immuniteettiin ja liikalihavuuteen liittyvät seerumikomponentit tutkitaan seeruminäytteistä (10 µl) korkean multipleksisen Olink- tai muilla immunomäärityksillä.

2.4 Seuranta purkamisen jälkeen

Ensimmäisestä synnytyksen jälkeisestä viikosta lähtien lasta seurataan hyvinvointiklinikalla normaalien kansallisten protokollien mukaisesti. Osana tutkimusta vanhemmat voivat olla yhteydessä Oulun yliopistollisen sairaalan lasten päivystykseen.

3 ja 12 kuukautta synnytyksen jälkeen vanhempia pyydetään täyttämään online-kysely lapsen terveydestä sekä keräämään ja lähettämään lapsen ja äidin ulostenäytteet XXOMNIgeneGUT (DNA genotek, Ontario, Kanada) putkiin mikrobiotaanalyysiä varten ja OMNImetGUT-putkiin. aineenvaihduntatuotteet ja säilytetään tilapäisesti huoneenlämmössä ennen siirtämistä Turun Microbiome Biopankkiin postitse. 3 kuukautta synnytyksen jälkeen ulostenäyte kerätään ennen toista suun kautta annettua rotavirusrokotusta, jos mahdollista. Ulostenäytteitä ei kerätä akuutin maha-suolikanavan infektion aikana.

Mikrobioottinäytteistä DNA eristetään Chemagic 360 -koneilla ja Chemagic Stool 200 H96 -pakkauksella (PerkinElmer, Turku, Suomi). Näytteet sekvensoidaan joko Turun yliopistollisessa sairaalassa, Kliinisessä mikrobiologiassa Illumina Nextseq 2000 -koneella tai Funktionaalisen genomiikkakeskuksessa Illumina Novaseq 6000 -koneella.

Mikrobiomin tulokset:

• 16S seuraavien sukupolvien sekvensointi
• Metagenomin sekvensointi ja kolonisaation lähde
• Mikrobiomista peräisin olevat ekstrasellulaariset vesikkelit: proteomi, bakteeri-16S
• Mikrobiota tuotti metaboliitteja
• Mikrobilääkeresistenssin geenit

Mikrobiomianalyysissä käytetään kehittynyttä bioinformatiikkaa. Kolonisaation lähde metagenomisekvensointia käyttämällä määritetään kuten aiemmin on raportoitu.

2.5 Kyselylomakkeet

Tietoa perheiden elämäntavoista, ympäristöaltistumisesta sekä tutkittavien vauvojen ja heidän vanhempiensa terveydestä kerätään verkkokyselyillä, jotka mahdollistavat seurannan ja tiedonhaun tiedonkeruun aikana. Vanhemmat täyttävät kyselylomakkeet ennen lapsen syntymää ja sen jälkeen. Vanhempia pyydetään täyttämään kyselylomakkeet lapsen ravinnosta, ruoansulatuskanavan toiminnasta ja hoitokäytännöistä 3 kuukauden iässä ja 12 kuukauden iässä. Kysymykset muuttuvat lapsen kasvaessa. Sairaudet, lääkitys sekä probioottien ja muiden ravintolisien käyttö raportoidaan kyselylomakkeissa. Ravitsemukseen, terveyteen ja taustaan ​​liittyvät kyselylomakkeet ovat pääosin samanlaisia ​​kuin käynnissä olevassa HELMi-tutkimuksessa ja Secflor-tutkimuksessa. Parantaakseen vastausprosentin vastaavuutta kyselyyn vanhemmat saavat automaattisia muistutuksia sähköpostitse ja tekstiviesteinä.

2.6 Potilastiedot

Perinataaliset tiedot saadaan sähköisistä synnytystiedoista, jotka koskevat vastasyntyneen hypoglykemiaa, glukoosipitoisuuksien seurantaa, suonensisäisen glukoosi-infuusion tarvetta ennen sairaalasta kotiutumista, kotiutuksen ikää, infektion oireita, infektioparametreja ja antibioottien käyttöä sairaalan aikana. oleskelua, kerätään sairaaloiden potilaskertomuksista. Kasvutiedot kolmen vuoden ikään asti mitattuna normaaleilla hyvinvointiklinikalla ja rokotuskäynneillä kerätään vanhemmilta tai hyvinvointiklinikalta. Kolmen vuoden ikään asti antibioottien ja muiden lääkkeiden käyttö kerätään kyselylomakkeilla ja vahvistetaan Kanta-palvelusta vanhempien kirjallisella luvalla.

2.7 Tehoanalyysi

Seulontaprosessin tuloksena odotetaan 40 %:n poissulkemisastetta B-ryhmän streptokokkien (GBS) kantajatilan vuoksi 24 %:lla alueemme raskaana olevista naisista ja muista positiivisista löydöksistä seulontanäytteissä. Koe on suunniteltu 150 äidin suunnitellulla otoksella, jolloin seulontapositiivisuuden vuoksi arviolta 40 % keskeyttäneiden koehenkilöiden lopullinen määrä on 90 (30 kussakin interventioryhmässä) ottaen huomioon, että se on todennäköisesti on keskeyttäneitä seurantajakson aikana. Mikrobiomitiedot ovat moniulotteisia, eivätkä binaaritulokset sovellu tehoanalyysiin.