Neugeborenes Kind einer Mutter mit Fettleibigkeit – Fäkale Mikrobiomtransplantation, RCT (NEMO-FMT)

1. HINTERGRUND

   In den letzten Jahrzehnten hat die Prävalenz von Fettleibigkeit bei Kindern weltweit dramatisch zugenommen. Bei adipösen Kindern und Jugendlichen ist die Wahrscheinlichkeit, im Erwachsenenalter adipös zu sein, etwa fünfmal höher als bei nicht adipösen Kindern. Obwohl Fettleibigkeit bei Kindern ein komplexes und multifaktorielles Ergebnis ist, scheint es, dass fettleibige Kinder bereits bei der Geburt ein anderes Darmmikrobiom haben. Viele der früheren Studien heben mütterliche Risikofaktoren wie einen höheren mütterlichen BMI vor der Schwangerschaft, übermäßige Gewichtszunahme während der Schwangerschaft, Schwangerschaftsdiabetes (GDM) und Kaiserschnitt als Risikofaktor für Übergewicht oder Fettleibigkeit im Kindesalter hervor. Perinatale Faktoren, insbesondere die Geburt per Kaiserschnitt sowie perinatale Antibiotika, wurden ebenfalls als entscheidende Faktoren für die Zusammensetzung und Entwicklung der Mikrobiota im frühen Leben identifiziert. Allerdings sind die Mechanismen nicht klar.

   Bei Müttern mit Fettleibigkeit und/oder Schwangerschaftsdiabetes wurde berichtet, dass sie eine mit Fettleibigkeit verbundene Darmmikrobiota haben. Die Veränderungen der Mikrobiota könnten während der vaginalen Geburt auf das Kind übertragen werden. Zuvor wurde die Metagenomsequenzierung erfolgreich zum Vergleich der Hauptquelle der Kolonisierung bei Säuglingen und der vertikalen Übertragung von Darmmikrobiota eingesetzt und zeigte, dass mehr als 70 % der Mikrobiota während der vaginalen Entbindung vertikal von der Mutter auf das Neugeborene übertragen werden.

   In Finnland ist die Kaiserschnittrate von 16-17 % auf 19,6 % aller Geburten gestiegen. Die geschätzten globalen Durchschnittsraten sind ähnlich, es wird jedoch erwartet, dass die Kaiserschnittrate von derzeit 21,1 % auf 28,5 % ansteigt. Es ist hypnotisiert, dass der Kaiserschnitt die vertikale Übertragung nützlicher Mikroben von der Mutter auf das Kind während eines kritischen Entwicklungsfensters stört. Zusätzlich zum Risiko für Fettleibigkeit erhöht ein Kaiserschnitt das Risiko für infektiöse und chronische Krankheiten wie Autoimmunerkrankungen, Asthma und sogar einige Krebsarten.

   Für die Wiederherstellung des Mikrobioms bei Neugeborenen im Kaiserschnitt bei Säuglingen wurden verschiedene Therapieansätze vorgeschlagen und getestet. Darmmikroben und mütterliche Darmstämme machen den beständigsten Anteil der neonatalen Darmmikrobiota nach der Geburt aus, während Vaginalbakterien und mütterliche Vaginalstämme nur einen kleinen und vorübergehenden Anteil ausmachen. In zwei Studien gelang es der Zusammensetzung der fäkalen Mikrobiota bei per Kaiserschnitt geborenen Säuglingen, die gestörte Übertragung intestinaler Bacteroides-Stämme durch vaginale Aussaat wiederherzustellen, während die orale Verabreichung der mütterlichen vaginalen Mikrobiota an Kaiserschnitt-Säuglinge keinen erkennbaren Einfluss auf die Zusammensetzung der Mikrobiota hatte. In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass eine Stuhltransplantation von der Mutter mit einem veröffentlichten Protokoll die Entwicklung der Darmmikrobiota von Säuglingen erfolgreich und sicher verändert.

   Da es Hinweise darauf gibt, dass es möglich ist, die Darmmikrobiota von Säuglingen während eines kritischen Entwicklungsfensters zu verändern, sind die metabolischen Konsequenzen und die klinische Bedeutung dieser Eingriffe unbekannt. Darüber hinaus ist nicht bekannt, welche Mikrobiota von wem langfristig für die Gesundheit des Kindes am besten geeignet wäre.

   Die Forscher gehen davon aus, dass Fettleibigkeit eine vertikal übertragene Krankheit sein könnte, da ein neugeborenes Kind von der Mutter mit Fettleibigkeit in Zusammenhang stehende Mikrobiota erhält. Darüber hinaus ist die Kolonisierungsquelle ein modifizierbarer Faktor und kann durch eine frühe fäkale Mikrobiota-Transplantation verändert werden.

2. STUDIENDESIGN UND -METHODEN

2.1. Rekrutierung und Screening von Stuhl- und Vaginalproben der Mutter

Die Hebammen und Ärzte informieren potenziell teilnehmende Mütter beim Besuch über die Studie und diejenigen, die an einer Teilnahme interessiert sind, werden von der Studienkrankenschwester kontaktiert. Nach Einverständniserklärung werden die Mütter spätestens 10–14 Tage vor der geplanten CS auf mögliche ansteckende Krankheiten getestet, wie unten erläutert. Der Mutter werden eine Stuhlprobe von 100 g und eine Blutprobe von 15 ml entnommen. Die Mutter teilt den Kot nach schriftlicher Anweisung in die verabreichten Probenröhrchen auf. Der Kot für die Transplantation wird mithilfe eines Löffels in der Kappe in einem leeren Röhrchen gesammelt. Die Mutter informiert die Forschungsschwester, die die zum Screening entnommenen Röhrchen so schnell wie möglich an das Labor liefert, wo aus der frischen Probe das Transplantat vorbereitet wird – dieser Vorgang ist in einem Zeitrahmen von 6 Stunden abgeschlossen.

Die frische Stuhlprobe wird auf das Vorhandensein von Parasiten sowie pathogenen Viren und Bakterien untersucht. Zur Bestimmung der bakteriellen Zusammensetzung der Probe wird ein Aliquot (0,125 g) der frischen Stuhlprobe verwendet. Vaginalproben werden während eines Besuchs zur Beurteilung der Art der Entbindung entnommen, sofern sie nicht bereits im Rahmen der routinemäßigen Nachsorge in einer Klinik für Mütterfürsorge entnommen wurden.

Bluttests: Komplettes Blutbild, Erythrozytensedimentationsrate, C-reaktives Protein, Alanin-Transaminase, alkalische Phosphatase, Gamma-Glutamyltransferase, Albumin, Kreatinin, HIV, Hepatitis B, C und E, Treponema pallidum, Humanes T-Zell-Leukämievirus, CMV und EBV

Vaginales und perineales Screening: Streptokokken der Gruppe B, Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA), Extended Spectrum Beta Lactamase (ESBL)

Stuhlscreening: Salmonella spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, Enterohämorrhagische E. coli (EHEC), Enteroinvasive E. coli (EIEC), Enterotoxigene E. coli (ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Norovirus, multiresistente gramnegative Bakterien (MDRGN), Vancomycin-resistente Enterococcus (VRE), Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Sars-CoV-2.

2.2 Transplantation fäkaler Mikrobiota

Ein weiterer Teil der frischen Stuhlprobe der Mutter wird als Transplantat verwendet. Zu diesem Zweck wird 1 g Stuhl in 15 ml isotonischer Kochsalzlösung und 10 % Glycerin gelöst, homogenisiert und die 0,5 ml-Aliquots des Transplantats sofort eingefroren und gelagert bei -80 °C.

Stuhltransplantation von einer normalgewichtigen, gesunden Spenderin (18 bis 35 Jahre) von der Turku Microbiome Biobank (Universität Turku und Turku University Hospital). Die Spenderin wird gleichzeitig mit der Mutter auf mögliche ansteckende Krankheiten getestet.

2.3 Nachsorge in der Mutter-Kind-Abteilung

Während des Krankenhausaufenthalts werden Stuhlproben vom ersten Stuhlgang im Leben und im Alter von zwei bis drei Tagen entnommen. Nach der ersten Fütterung erfolgt die Nachsorge des Neugeborenen gemäß den Krankenhausprotokollen auf der Rooming-in-Station. In früheren Studien wurde selten über Fieber bei Neugeborenen berichtet, die eine Stuhltransplantation erhalten hatten. Mögliche unerwünschte Ereignisse wie erhöhte Peristaltik, Durchfall, Erbrechen, Fieber und Hautausschlag werden an die elektronische Datenbank der Patientenakten gemeldet und von dort von den Forschern gesammelt. Vor der Entlassung wird das Kind gewogen und die Entlassungsuntersuchung wird von einem Kinderarzt oder einem auf Pädiatrie spezialisierten Arzt durchgeführt, typischerweise am zweiten Tag nach der Geburt.

Im Alter von 2 Tagen werden gleichzeitig mit dem Screening der Proben auf SCID und Stoffwechselerkrankungen periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus Kapillarblutproben (100 µl) aus der Ferse isoliert und bei -140 °C gelagert. Das Serum wird abgetrennt und bei -80 °C gelagert. Die Zellen werden Analysen unterzogen, einschließlich der Einzelzell-mRNA-Sequenzierung zur Untersuchung der Genexpressionsniveaus und der Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie zur Untersuchung der Verteilung von Immunzelltypen sowie funktioneller Eigenschaften, einschließlich Aktivierung und Oberflächenrezeptoren. Die entzündungs-, immunitäts- und fettleibigkeitsbedingten Serumbestandteile werden aus Serumproben (10 µl) durch Hochmultiplex-Olink- oder andere Immunoassays untersucht.

2.4 Nachsorge nach der Entlassung

Ab der ersten Woche nach der Geburt wird der Säugling in der Well-Baby-Klinik gemäß den landesüblichen Protokollen betreut. Im Rahmen der Studie können die Eltern mit der pädiatrischen Notaufnahme des Universitätskrankenhauses Oulu in Kontakt treten.

3 und 12 Monate nach der Geburt werden die Eltern gebeten, einen Online-Fragebogen zur Gesundheit des Kindes auszufüllen und die Stuhlproben des Säuglings und der Mutter zu sammeln und an die XXOMNIgeneGUT-Röhrchen (DNA genotek, Ontario, Kanada) zur Mikrobiota-Analyse und an OMNImetGUT-Röhrchen zu senden Metaboliten entnommen und vorübergehend bei Raumtemperatur gelagert, bevor sie per Post an die Turku Microbiome Biobank übertragen werden. 3 Monate nach der Geburt wird die Stuhlprobe nach Möglichkeit vor der zweiten oral verabreichten Rotavirus-Impfung entnommen. Bei einer akuten Magen-Darm-Infektion werden keine Stuhlproben entnommen.

DNA aus den Mikrobiota-Proben wird mit Chemagic 360-Geräten und dem Chemagic Stool 200 H96-Kit (PerkinElmer, Turku, Finnland) isoliert. Die Proben werden entweder im Turku University Hospital, Clinical Microbiology, auf einem Illumina Nextseq 2000-Gerät oder im finnischen Functional Genomics Center auf einem Illumina Novaseq 6000-Gerät sequenziert.

Mikrobiom-Ergebnisse:

• 16S-Sequenzierung der nächsten Generation
• Metagenomsequenzierung und Kolonisierungsquelle
• Von Mikrobiomen abgeleitete extrazelluläre Vesikel: Proteom, bakterielles 16S
• Mikrobiota produzierte Metaboliten
• Gene für antimikrobielle Resistenz

Für die Mikrobiomanalyse wird fortschrittliche Bioinformatik eingesetzt. Die Besiedlungsquelle mittels Metagenomsequenzierung wird wie zuvor berichtet bestimmt.

2.5 Fragebögen

Mithilfe von Online-Fragebögen werden Daten zum Lebensstil der Familien, zu Umweltbelastungen und zur Gesundheit der Studienkinder und ihrer Eltern erhoben, was eine Überwachung und Datenabfrage während der Datenerfassung ermöglicht. Fragebögen werden von den Eltern vor der Geburt des Kindes und auch danach ausgefüllt. Die Eltern werden gebeten, Fragebögen zur Ernährung, Magen-Darm-Funktion und Pflegepraktiken des Kindes im Alter von 3 Monaten und 12 Monaten auszufüllen. Die Fragen ändern sich, wenn das Kind wächst. In den Fragebögen werden Krankheiten, Medikamente und die Einnahme von Probiotika und anderen Nahrungsergänzungsmitteln angegeben. Die Fragebögen zu Ernährung, Gesundheit und Hintergrund ähneln weitgehend denen der laufenden HELMi-Studie und der Secflor-Studie. Um die Einhaltung der Rücklaufquoten auf den Fragebogen zu verbessern, erhalten Eltern automatische Erinnerungen per E-Mail und SMS-Nachrichten.

2.6 Patientenakten

Die perinatalen Daten werden aus elektronischen Entbindungsdaten bezüglich der Hypoglykämie des Neugeborenen, der Nachverfolgung des Glukosespiegels, der Notwendigkeit einer intravenösen Glukoseinfusion vor der Entlassung aus dem Krankenhaus, dem Alter bei der Entlassung, den Symptomen einer Infektion, dem Niveau der Infektionsparameter und dem Einsatz von Antibiotika während des Krankenhausaufenthalts gewonnen Aufenthalt, werden aus den Patientenakten des Krankenhauses erfasst. Wachstumsdaten bis zum Alter von drei Jahren, gemessen bei normalen Besuchen in der Well-Baby-Klinik, und Impfdaten werden von Eltern oder von Well-Baby-Kliniken gesammelt. Die Einnahme von Antibiotika und anderen Medikamenten bis zum Alter von drei Jahren wird über Fragebögen erhoben und mit schriftlicher Genehmigung der Eltern vom Kanta-Service bestätigt.

2.7 Leistungsanalyse

Aufgrund des Screening-Prozesses wird eine Ausschlussrate von 40 % erwartet, da 24 % der schwangeren Frauen in unserer Region Träger von Streptokokken der Gruppe B (GBS) sind und andere positive Ergebnisse in den Screening-Proben vorliegen. Der Versuch ist auf eine geplante Stichprobe von 150 Müttern ausgelegt, so dass die endgültige Zahl der Probanden mit einer geschätzten Abbrecherquote von 40 % aufgrund von Screening-Positivität 90 (30 in jeder Interventionsgruppe) beträgt, wenn man berücksichtigt, dass dies wahrscheinlich ist es zu Aussetzern während der Nachbeobachtungszeit kommt. Mikrobiomdaten sind mehrdimensional und binäre Ergebnisse eignen sich nicht für die Leistungsanalyse.