Recém-nascido de mãe com obesidade - Transplante de microbioma fecal, RCT (SISU-FMT)

1. FUNDO

   Nas últimas décadas, a prevalência da obesidade em crianças aumentou dramaticamente em todo o mundo. Crianças e adolescentes obesos têm cerca de cinco vezes mais probabilidade de serem obesos na idade adulta do que aqueles que não são obesos. Embora a obesidade infantil seja um resultado complexo e multifatorial, parece que as crianças obesas apresentam um microbioma intestinal diferente já ao nascer. Muitos dos estudos anteriores destacam fatores de risco maternos, como maior IMC materno antes da gravidez, ganho excessivo de peso gestacional, diabetes gestacional (DMG) e cesariana como fator de risco para sobrepeso ou obesidade infantil. Os factores perinatais, em particular o nascimento por cesariana, bem como os antibióticos perinatais, também foram identificados como um determinante crítico da composição e desenvolvimento da microbiota no início da vida. No entanto, os mecanismos não são claros.

   Foi relatado que mães com obesidade e/ou diabetes gestacional apresentam microbiota intestinal associada à obesidade. As alterações na microbiota podem ser transmitidas à criança durante o parto vaginal. Anteriormente, o sequenciamento do metagenoma foi usado com sucesso para comparar a principal fonte de colonização em bebês e a transmissão vertical da microbiota intestinal e mostrou que> 70% da microbiota é transmitida verticalmente da mãe para o recém-nascido durante o parto vaginal.

   Na Finlândia, a taxa de cesarianas aumentou de 16-17% para 19,6% de todos os nascimentos. As taxas médias globais estimadas são semelhantes, mas espera-se que a taxa de cesarianas aumente dos atuais 21,1% para 28,5%. É hipnotizado que a cesariana interrompe a transmissão vertical de micróbios benéficos da mãe para o bebê durante uma janela crítica de desenvolvimento. Além do risco de obesidade, a cesariana aumenta o risco de doenças infecciosas e crônicas, como doenças autoimunes, asma e até alguns tipos de câncer.

   Diferentes abordagens terapêuticas foram propostas e testadas para a restauração do microbioma neonatal em cesarianas em bebês. Os micróbios intestinais e as cepas intestinais maternas contribuem com a proporção mais persistente da microbiota intestinal neonatal após o nascimento, enquanto as bactérias vaginais e as cepas vaginais maternas constituem apenas uma fração pequena e transitória. Em dois estudos, as composições da microbiota fecal em bebês nascidos por cesariana conseguiram restaurar a transmissão interrompida de cepas intestinais de Bacteroides por semeadura vaginal, enquanto a administração oral da microbiota vaginal materna a bebês de cesariana não teve efeito discernível na composição da microbiota. Num estudo anterior, o transplante fecal da mãe, com um protocolo publicado, demonstrou modificar o desenvolvimento da microbiota intestinal dos bebés com sucesso e segurança.

   Como existem evidências de que é possível modificar a microbiota intestinal dos bebês durante uma janela crítica de desenvolvimento, as consequências metabólicas e o significado clínico dessas intervenções são desconhecidos. Além disso, não se sabe que tipo de microbiota e de quem seria melhor para a saúde da criança a longo prazo.

   Os investigadores levantam a hipótese de que a obesidade pode ser uma doença transmitida verticalmente quando um recém-nascido recebe da mãe microbiota relacionada à obesidade. Além disso, a fonte de colonização é um fator modificável e pode ser alterada através de um transplante precoce de microbiota fecal.

2. DESENHO E MÉTODOS DO ESTUDO

2.1. Recrutamento e triagem de amostras fecais e vaginais da mãe

As parteiras e os médicos informam as mães potencialmente participantes do estudo na consulta e as interessadas em participar são contatadas pela enfermeira do estudo. Após consentimento informado, as mães são testadas para possíveis doenças contagiosas, conforme explicado abaixo, o mais tardar 10-14 dias antes da CE agendada. Uma amostra de fezes de 100 g e uma amostra de sangue de 15 mL são coletadas da mãe. A mãe divide as fezes nos tubos de amostra administrados de acordo com instruções escritas. As fezes para transplante são coletadas em um tubo vazio com uma colher na tampa. A mãe informa a enfermeira pesquisadora, que entrega os tubos levados para triagem o mais rápido possível ao laboratório, onde é preparado o transplante a partir da amostra fresca - esse processo é concluído no prazo de 6 horas.

A amostra fecal fresca é examinada quanto à presença de parasitas e vírus e bactérias patogênicas. Uma alíquota (0,125 g) da amostra fecal fresca é usada para determinar a composição bacteriana da amostra. Amostras vaginais serão obtidas durante uma visita para avaliação do tipo de parto, caso ainda não tenham sido obtidas na clínica de bem-estar materno como parte do acompanhamento de rotina.

Exames de sangue: hemograma completo, velocidade de hemossedimentação, proteína C reativa, alanina transaminase, fosfatase alcalina, gama-glutamil transferase, albumina, creatinina, HIV, hepatite B, C e E, Treponema pallidum, vírus da leucemia de células T humanas, CMV e EBV

Triagem vaginal e perineal: Estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), Beta Lactamase de espectro estendido (ESBL)

Triagem fecal: Salmonella spp., Shigella sp., Campylobacter coli/jejuni, Yersinia enterocolitica, E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enterotoxigênica (ETEC), Vibrio sp., Plesiomonas shigelloides, Clostridium difficile, Cryptosporidium spp., Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Norovírus, bactérias gram negativas multirresistentes (MDRGN), Enterococcus resistente à vancomicina (VRE), Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, Sars-CoV-2.

2.2 Transplante de microbiota fecal

Outra parte da amostra fecal fresca da mãe é utilizada como transplante e para isso 1 g de fezes é dissolvido em 15 mL de solução salina isotônica e glicerol 10%, homogeneizado, e as alíquotas de 0,5 mL do transplante são imediatamente congeladas e armazenadas a -80°C.

Transplante fecal de doadora feminina saudável, com peso normal (18 a 35 anos) do Turku Microbiome Biobank (Universidade de Turku e Hospital Universitário de Turku). O doador é testado para possíveis doenças contagiosas simultaneamente como mãe.

2.3 Acompanhamento na unidade mãe e bebê

Durante a internação hospitalar, são coletadas amostras fecais das primeiras fezes da vida e aos dois a três dias de idade. Após a primeira alimentação o recém-nascido é acompanhado conforme protocolos hospitalares no alojamento conjunto. Em estudos anteriores, a febre foi relatada raramente em recém-nascidos que receberam transplante fecal. Possíveis eventos adversos, como aumento do peristaltismo, diarreia, vômito, febre e erupção cutânea, são relatados no banco de dados eletrônico de prontuários dos pacientes e coletados a partir daí pelos pesquisadores. Antes da alta, a criança é pesada e o exame de alta é realizado pelo pediatra ou médico especialista em pediatria, normalmente no 2º dia pós-natal.

Aos 2 dias de idade, simultaneamente às amostras de triagem para SCID e doenças metabólicas, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas de amostras de sangue capilar (100 µl) retiradas do calcanhar e armazenadas a -140°C. O soro é separado e armazenado a -80°C. As células são submetidas a análises, incluindo sequenciamento de mRNA de célula única para examinar os níveis de expressão gênica e imunofenotipagem por citometria de fluxo para examinar a distribuição de tipos de células imunes, bem como propriedades funcionais, incluindo ativação e receptores de superfície. Os componentes séricos relacionados com inflamação, imunidade e obesidade são examinados a partir de amostras de soro (10 µl) por Olink de alta multiplexação ou outros imunoensaios.

2.4 Acompanhamento após alta

A partir da primeira semana pós-natal, o bebé é acompanhado na clínica do bebé saudável de acordo com os protocolos nacionais normais. Como parte do estudo, os pais podem entrar em contato com o pronto-socorro pediátrico do Hospital Universitário de Oulu.

Aos 3 e 12 meses pós-natal, os pais são solicitados a preencher um questionário on-line sobre a saúde da criança e coletar e enviar as amostras fecais do bebê e da mãe para os tubos XXOMNIgeneGUT (DNA genotek, Ontário, Canadá) para análise da microbiota e para tubos OMNImetGUT para metabólitos e armazenados temporariamente em temperatura ambiente antes da transferência para o Turku Microbiome Biobank por correio. Aos 3 meses pós-natal, a amostra fecal é coletada antes da segunda vacinação oral contra o rotavírus, se possível. Amostras fecais não são coletadas durante a infecção gastrointestinal aguda.

O DNA das amostras de microbiota será isolado usando máquinas Chemagic 360 e kit Chemagic Stool 200 H96 (PerkinElmer, Turku, Finlândia). As amostras serão sequenciadas no Hospital Universitário de Turku, Microbiologia Clínica em uma máquina Illumina Nextseq 2000 ou no Centro Finlandês de Genômica Funcional em uma máquina Illumina Novaseq 6000.

Resultados do microbioma:

• Sequenciamento das próximas gerações 16S
• Sequenciamento do metagenoma e fonte de colonização
• Vesículas extracelulares derivadas de microbioma: proteoma, 16S bacteriano
• Metabólitos produzidos pela microbiota
• Genes de resistência antimicrobiana

Bioinformática avançada será usada para análise de microbioma. A fonte de colonização usando sequenciamento de metagenoma será determinada conforme relatado anteriormente.

2.5 Questionários

São coletados dados sobre o estilo de vida das famílias, as exposições ambientais e a saúde dos bebês do estudo e de seus pais por meio de questionários on-line, possibilitando o monitoramento e a consulta de dados durante a coleta de dados. Os questionários são preenchidos pelos pais antes do nascimento do bebê e posteriormente. Os pais são solicitados a preencher questionários sobre nutrição, função gastrointestinal e práticas de cuidado da criança nos 3 meses e nos 12 meses de idade. As perguntas mudam à medida que a criança cresce. Doenças, medicamentos e uso de probióticos e outros suplementos alimentares são relatados nos questionários. Os questionários relacionados com nutrição, saúde e antecedentes são principalmente semelhantes aos do estudo HELMi e do estudo Secflor em curso. Para melhorar a conformidade das taxas de resposta ao questionário, os pais recebem lembretes automáticos via e-mail e mensagens SMS.

2.6 Registros de pacientes

Os dados perinatais serão obtidos a partir de dados do registro eletrônico de parto referentes à hipoglicemia do recém-nascido, acompanhamento dos níveis de glicose, necessidade de infusão intravenosa de glicose antes da alta hospitalar, idade na alta hospitalar, sintomas de infecção, níveis de parâmetros de infecção e uso de antibióticos durante a internação. estadia, serão coletados dos prontuários dos pacientes dos hospitais. Os dados de crescimento até a idade de três anos medidos durante visitas normais a clínicas de bebês saudáveis ​​e os dados de vacinação serão coletados dos pais ou de clínicas de bebês saudáveis. O uso de antibióticos e outros medicamentos até os três anos de idade será coletado por meio de questionários e confirmado no serviço Kanta com permissão por escrito dos pais.

2.7 Análise de potência

Como resultado do processo de triagem, espera-se uma taxa de exclusão de 40% porque o portador de estreptococos do grupo B (GBS) indica 24% das mulheres grávidas em nossa região e outros resultados positivos nas amostras de triagem. O ensaio foi concebido com uma amostra planeada de 150 mães, permitindo que o número final de indivíduos com uma taxa de abandono estimada de 40% devido à positividade do rastreio seja de 90 (30 em cada grupo de intervenção), tendo em consideração que é provável que têm desistências durante o período de acompanhamento. Os dados do microbioma são multidimensionais e os resultados binários não são adequados para análise de poder.