단순 포진 각막염(HSK)에 대한 두 가지 잠재적 진단 검사의 효능

전략

환자 모집 기준에서 아래에 설명된 기준을 충족하는 안과 부서에 참석하는 환자는 이 연구에 대한 자원 봉사에 대한 서면 동의를 요청받게 됩니다. 눈물을 제거하고 추가 분석까지 -70도에서 멸균 라벨이 붙은 에펜도르프에 보관합니다. 염증이 있는 각막에서 인상 세포학 샘플을 채취하여 바이러스 수송 배지에 저장하고 추출 및 보관 절차를 위해 벨파스트 지역 바이러스 실험실로 보냅니다. 항체 검사를 위해 쌍을 이룬 3개월 샘플을 사용할 수 있을 때까지 혈액 샘플을 채취하여 적절하게 보관합니다. 단일 클론 항체는 아래에 설명된 대로 HSK의 생체 내 진단에 적용되며 생체 내 공초점 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다. 결과의 사진 증거는 각 환자에 대해 기록됩니다. 중첩된 실시간 PCR 분석 및 단클론 항체 테스트에 대한 데이터는 연구가 진행됨에 따라 각 환자에 대해 다른 개인에 의해 별도로 기록됩니다. 연구가 진행됨에 따라 눈물 및 혈액 검사 결과로 환자 기록도 업데이트됩니다.

채용 가능성:

RVH Belfast의 200명 이상의 안구 환자, Bedford의 300명 이상의 환자 및 Birmingham의 BMEC의 600명 이상의 환자가 매년 HSV-1 감염이 의심되는 경우 국소 아시클로버로 치료를 받습니다. 지역사회 내에서 GP가 치료하는 환자의 수는 이 숫자를 크게 증가시킬 것입니다. 이 환자의 대다수는 헤르페스 감염에 대한 검사실 확인을 받은 적이 없습니다. 매년 각 병원을 통한 환자 처리량은 3년 기간 동안 이 연구에 대한 적절한 모집을 가능하게 해야 합니다. 이것은 연구가 환자 수의 관점에서 전적으로 실행 가능함을 보장해야 합니다.

실행 가능한 연구에 필요한 환자 수

현재 우리는 제안된 두 가지 진단 분석의 민감도를 알지 못하기 때문에 통계 검정력 계산을 수행할 수 없습니다. Kaye SB20., et al의 이전 연구는 인간 각막에서 사용될 때 82%의 민감도를 가진 PCR 기술을 제안했습니다. 이에 비해 여기서 사용되는 PCR 기술은 실시간 분석과 중첩된 방법론을 사용하기 때문에 감도가 훨씬 우수해야 합니다. 이러한 테스트는 숙련된 상담 안과 전문의의 임상 진단과 비교됩니다.

유효한 연구에 필요한 모집 수준을 계산하기 위해 통계 검정력 계산의 필요성을 인정합니다. 따라서 우리는 50명의 환자에 대해 이러한 모든 진단 분석을 사용하여 초기 연구를 수행할 것이며 이 결과는 적절한 수를 보장하기 위해 McNemar의 테스트21에 기반한 민감도의 일면 등가에 대한 표본 크기 방법을 사용하여 검정력 계산을 수행하는 데 사용될 것입니다. 모집합니다. 또한 연구에서 환자가 탈락할 수 있도록 초과 모집(이 필수 수보다 20% 이상)을 희망합니다.

환자 모집 기준

각막염의 원인 진단이 어렵고 HSK를 배제해야 하는 16세 이상의 환자를 본 연구에 등록한다. 전신 스테로이드 치료를 받는 환자를 포함한 면역억제 환자는 제외됩니다. 모든 환자는 구두 및 서면 동의를 받아야 합니다. 모든 환자는 임상 요구 사항에 따라 계속 추적됩니다. 일상적인 평가 외에도 담당 컨설턴트가 (a) 가지고 있고 (b) 가지고 있지 않다고 생각하는 환자에 대한 추가 임상 분류가 헤르페스 감염과 일치하는 임상 증거를 기록합니다.

생체 내 면역 형광 진단 절차

30 마이크로리터의 형광 표지된 mAB(2mg/ml)(Sharma A., et al7의 이전 연구에서 사용된 것과 동일한 mAB)를 일반 식염수 용액에 넣어 눈에 적용합니다. 20분 후 결합되지 않은 항체는 식염수로 씻어냅니다. 가능한 경우 슬릿 램프 또는 생체 내 공초점 현미경으로 눈을 볼 수 있습니다. 각막 층을 통한 mAB 침투가 기록됩니다. 또한 간질 염증의 증거가 기록되고 특정 형광과의 관계가 기록됩니다. 이것은 잠재적인 바이러스에 대한 면역학적 반응보다는 원인 효과로서 활동성 헤르페스 감염(상피, 간질 또는 둘 다의 특정 형광에 의한)의 기여를 나타낼 것입니다.

중첩된 실시간 PCR 기술을 사용한 생체 내 결과 비교

중첩된 실시간 PCR 분석을 사용하여 바이러스 항원의 존재/부재를 확인하기 위해 항체를 적용하기 전에 인상 세포학을 수행합니다. 핵산 증폭 테스트 사용과 관련된 앰플리콘 오염의 가능성은 잘 알려져 있으며 (a) 별도의 지정된 워크스테이션 및 (b) 시료 준비에서 증폭 제품 분석까지의 단방향 작업 흐름의 사용을 의무화합니다. 이 작동 모델은 지역 바이러스 연구소에서 표준입니다. 따라서 모든 PCR 실험은 벨파스트 RVH 지역 바이러스학 연구소의 Hugh O'Neill 박사의 감독하에 수행됩니다.

인상 세포학 샘플은 바이러스 수송 배지로 실험실로 보내질 것입니다. 각 표본은 세포 내용물을 재현탁하기 위해 실험실에서 수령 시 15초 동안 와동됩니다. PCR을 위해 볼륨이 제거되고 나머지는 저장됩니다.

Nested PCR은 HSV-1 gpD 유전자를 인식하는 프라이머를 사용하여 수행됩니다(HSV-1 외부 제품은 각각 221 및 184 염기쌍(bp)이고 내부 제품은 각각 138 및 101 bp임). Hot-start PCR은 Perkin Elmer GeneAmp 2400 열순환기에서 10μl 시료와 40μl 혼합액을 사용하여 수행하고 35회의 1차 순환 주기를 거칩니다. 1마이크로리터의 제품이 25초 라운드 주기 동안 49μl의 두 번째 라운드 믹스로 옮겨집니다. 헤르페스 눈 감염 이력이 없는 신병의 염증이 없는 눈에서 채취한 인상 세포학 샘플은 알려진 음성 샘플로 사용됩니다. 양성 HSV 대조군과 증류수 음성 대조군도 각 실행에 포함됩니다. 1차 및 2차 제품은 ethidium bromide로 염색된 2% 아가로스 젤에 함께 시각화되어 촬영됩니다(폴라로이드). 두 번째 라운드에만 존재하거나 첫 번째 라운드와 두 번째 라운드 모두에 존재하는 적절한 크기의 밴드는 각각 양성 및 강한 양성으로 기록됩니다. 모든 양성 검체는 재검사됩니다.

PCR 검사를 담당하는 실험실 직원은 생체 내 항체 검사 결과를 알지 못합니다. 단일클론항체 in vivo 분석과 nested real time PCR 진단의 민감도와 특이도를 비교합니다.

안구 표면 염증 환경에 대한 mAB의 효과 조사 일반적인 사이토카인 프로필의 분석은 두 가지 다른 시점에서 눈물의 사이토카인 프로필을 모니터링하여 평가할 것입니다: 단클론 항체 치료 전과 다시 항체 적용 후 30분. 눈물의 사이토카인 프로파일은 단백질 바이오칩(RANDOX Labs. Ltd.)는 염증 유발 및 항염증성 사이토카인 배열을 동시에 정량적으로 검출할 수 있습니다. 활동성 헤르페스 감염이 의심되지만 항체를 투여받지 않은 환자의 눈물 샘플이 대조군으로 사용됩니다. 이러한 분석을 통해 모노클로날 항체에 대한 잠재적인 염증/면역 반응에 관한 진술을 할 수 있습니다.

잠재적인 전신 면역 반응 조사 마우스 mAB 기존 항체의 존재를 테스트하기 위해 단클론 항체를 적용하기 전에 응고된 혈액 10밀리리터를 채취합니다. 또한 3개월 검진 시 추가로 10ml의 혈액을 채취하여 단일 클론을 각막에 적용한 후 3개월 인터페이스에서 형성되었을 수 있는 항체에 대해 다시 분석합니다.

무혈성 각막은 항체에 대한 면역 반응의 가능성을 낮추는 면역학적 특권 부위로 생각됩니다.