A eficácia de dois ensaios diagnósticos potenciais para ceratite por herpes simples (HSK)

Estratégia

Os pacientes atendidos nos departamentos de oftalmologia, que preencham os critérios descritos abaixo nos critérios de recrutamento de pacientes, serão solicitados a fornecer consentimento por escrito para serem voluntários neste estudo. As lágrimas serão removidas e armazenadas em um eppendorf rotulado estéril a -70 graus C até análise posterior. Uma amostra de citologia de impressão será retirada da córnea inflamada e armazenada em meio de transporte viral e enviada ao laboratório regional de virologia, Belfast, para procedimentos de extração e armazenamento. Amostras de sangue serão coletadas e armazenadas adequadamente até que as amostras pareadas de 3 meses estejam disponíveis para teste de anticorpos. O anticorpo monoclonal será aplicado para o diagnóstico in vivo de HSK conforme descrito abaixo e visualizado usando um microscópio confocal in vivo. A evidência fotográfica do resultado será registrada para cada paciente. Os dados para a análise de PCR aninhada em tempo real e o teste de anticorpo monoclonal serão registrados separadamente por diferentes indivíduos para cada paciente à medida que o estudo avança. Os registros dos pacientes também serão atualizados com os resultados dos exames lacrimais e de sangue à medida que o estudo avança.

Potencial de Recrutamento:

Mais de 200 pacientes oftalmológicos no RVH Belfast, mais de 300 pacientes em Bedford e mais de 600 pacientes no BMEC em Birmingham são tratados anualmente com aciclovir tópico para suspeita de infecção por HSV-1. O número de pacientes tratados na comunidade por GPs aumentaria significativamente esse número. A grande maioria desses pacientes nunca teve nenhuma confirmação laboratorial de infecção herpética. O fluxo de pacientes em cada hospital a cada ano deve permitir o recrutamento adequado para este estudo durante o período de três anos. Isso deve garantir que o estudo seja totalmente viável do ponto de vista do número de pacientes.

Números de pacientes necessários para um estudo viável

No momento, não podemos realizar cálculos estatísticos de poder, pois não temos conhecimento da sensibilidade de nenhum dos dois ensaios diagnósticos propostos. Trabalhos anteriores de Kaye SB20., et al sugeriram uma técnica de PCR com sensibilidade de 82% quando usada em córneas humanas). Em contraste, a técnica de PCR usada aqui deve ter uma sensibilidade muito superior devido ao uso de análise em tempo real e à metodologia aninhada usada. Esses testes serão comparados com o diagnóstico clínico de um oftalmologista experiente.

Aceitamos a necessidade de cálculos de poder estatístico para calcular um nível de recrutamento necessário para um estudo válido. Portanto, realizaremos um estudo inicial usando todos esses ensaios diagnósticos em 50 pacientes e os resultados serão usados ​​para realizar cálculos de poder usando o método do tamanho da amostra para equivalência unilateral de sensibilidades com base no teste de McNemar21 para garantir números adequados são recrutados. Além disso, esperamos recrutar mais (20% acima desse número necessário) para permitir o abandono do paciente do estudo.

Critérios de Recrutamento de Pacientes

Pacientes com idade superior a 16 anos em que a causa da ceratite é difícil de diagnosticar e em que HSK deve ser excluído serão incluídos neste estudo. Pacientes imunossuprimidos, incluindo pacientes tratados com esteroides sistêmicos, serão excluídos. A todos os pacientes será solicitado consentimento verbal e por escrito. Todos os pacientes continuarão sendo acompanhados de acordo com as necessidades clínicas. Além da avaliação de rotina, a categorização clínica adicional feita pelos consultores assistentes nos pacientes considerados (a) com e (b) sem evidência clínica de infecção herpética será registrada.

Procedimento de diagnóstico de imunofluorescência in vivo

30 microlitros de mAB marcado com fluorescente (2mg/ml), (mesmo mAB usado no estudo anterior por Sharma A., et al7) em solução salina normal serão aplicados no olho. Após 20 minutos, o anticorpo não ligado será lavado com solução salina. O olho será visualizado com uma lâmpada de fenda ou um microscópio confocal in vivo, se disponível. A penetração do mAB através das camadas da córnea será registrada. Além disso, serão registradas evidências de inflamação estromal e observada sua relação com a fluorescência específica. Isso indicará a contribuição da infecção herpética ativa (por fluorescência específica no epitélio, estroma ou ambos) como um efeito causador, em vez de uma resposta imunológica ao vírus latente.

Comparação dos resultados in vivo com a técnica de PCR em tempo real aninhada

A citologia de impressão será realizada, antes da aplicação do anticorpo, para confirmar a presença/ausência de antígenos virais usando análise de PCR aninhada em tempo real. O potencial de contaminação do amplicon associado ao uso do teste de amplificação de ácido nucleico é bem reconhecido e torna obrigatório o uso de (a) estações de trabalho separadas e designadas e (b) um fluxo de trabalho unidirecional desde a preparação da amostra até a análise do produto amplificado; esse modelo de operação é padrão no laboratório regional de virologia. Todos os experimentos de PCR serão, portanto, realizados sob a supervisão do Dr. Hugh O'Neill no Regional Virology Laboratory, RVH, Belfast.

As amostras de citologia de impressão serão enviadas para o laboratório em meio de transporte viral. Cada amostra será agitada por 15 segundos no recebimento no laboratório para ressuspender o conteúdo celular. Um volume será removido para PCR e o restante será armazenado.

A nested PCR será realizada usando primers que reconhecem o gene HSV-1 gpD (os produtos externos do HSV-1 serão 221 e 184 pares de base (pb) enquanto os produtos internos serão 138 e 101 bp, respectivamente). A PCR de início a quente será realizada em um termociclador Perkin Elmer GeneAmp 2400 com 10 μl de amostra mais 40 μl de mistura e submetido a 35 primeiros ciclos. Um microlitro de produto será transferido para 49μl de mistura de segunda rodada para 25 ciclos de segunda rodada. Amostras de citologia de impressão retiradas de olhos não inflamados de recrutas sem histórico de infecção ocular herpética serão usadas como amostras negativas conhecidas. Um controle HSV positivo e um controle negativo de água destilada também serão incluídos em cada corrida. Os produtos da primeira e da segunda rodada serão visualizados juntos em géis de agarose a 2% corados com brometo de etídio e fotografados (Polaroid). Bandas de tamanho apropriado presentes apenas na segunda rodada, ou presentes na primeira e na segunda rodadas, serão registradas como positivas e fortemente positivas, respectivamente. Todas as amostras positivas serão testadas novamente.

A equipe de laboratório responsável pelo teste de PCR não terá conhecimento dos resultados do teste de anticorpos in vivo. A comparação será feita entre a sensibilidade e especificidade do ensaio de anticorpo monoclonal in vivo e o diagnóstico por PCR em tempo real nested.

Investigando o efeito do mAB no meio inflamatório da superfície ocular A análise do perfil geral de citocinas também será avaliada monitorando o perfil de citocinas das lágrimas em dois momentos diferentes: antes do tratamento com anticorpo monoclonal e novamente 30 minutos após a aplicação do anticorpo. O perfil de citocinas das lágrimas será analisado usando proteômica com um biochip de proteína (RANDOX Labs. Ltd.) capaz de detecção quantitativa simultânea de uma série de citocinas pró e anti-inflamatórias. Amostras de lágrimas de pacientes com suspeita de infecção herpética ativa, mas que não receberam anticorpos, servirão como controle. Tal análise permitirá que sejam feitas afirmações sobre a potencial reação inflamatória/imunológica ao anticorpo monoclonal.

Investigando uma potencial reação imunológica sistêmica, o mAB de camundongo Dez mililitros de sangue coagulado serão colhidos antes da aplicação do anticorpo monoclonal para testar a presença de anticorpo pré-existente. Além disso, no check-up de 3 meses, mais 10 mililitros de sangue serão coletados e analisados ​​novamente quanto a anticorpos que possam ter se formado na interface de três meses após a aplicação do monoclonal na córnea.

Acredita-se que a córnea avascular seja um local imunologicamente privilegiado, tornando menos provável o potencial de uma resposta imune ao anticorpo.