L'efficacia di due potenziali test diagnostici per la cheratite da herpes simplex (HSK)

Strategia

Ai pazienti che frequentano i reparti di oftalmologia, che soddisfano i criteri descritti di seguito nei criteri di reclutamento dei pazienti, verrà chiesto il consenso scritto per fare volontariato per questo studio. Le lacrime verranno rimosse e conservate in un eppendorf etichettato sterile a -70 gradi C fino a ulteriori analisi. Un campione di citologia ad impressione verrà prelevato dalla cornea infiammata e conservato in mezzo di trasporto virale e inviato al laboratorio di virologia regionale, Belfast per le procedure di estrazione e conservazione. I campioni di sangue verranno prelevati e conservati in modo appropriato fino a quando i campioni di 3 mesi accoppiati non saranno disponibili per il test anticorpale. L'anticorpo monoclonale verrà applicato per la diagnosi in vivo di HSK come descritto di seguito e visualizzato utilizzando un microscopio confocale in vivo. La prova fotografica del risultato sarà registrata per ogni paziente. I dati per l'analisi PCR annidata in tempo reale e il test degli anticorpi monoclonali saranno registrati separatamente da individui diversi per ciascun paziente man mano che lo studio procede. Le cartelle dei pazienti verranno inoltre aggiornate con i risultati degli esami lacrimali e del sangue man mano che lo studio procede.

Potenziale di reclutamento:

Oltre 200 pazienti oculisti nel RVH di Belfast, oltre 300 pazienti a Bedford e oltre 600 pazienti nel BMEC di Birmingham vengono trattati ogni anno con aciclovir topico per sospetta infezione da HSV-1. Il numero di pazienti curati all'interno della comunità dai medici generici aumenterebbe significativamente questo numero. La stragrande maggioranza di questi pazienti non avrà mai avuto alcuna conferma di laboratorio di infezione erpetica. Il numero di pazienti in ciascun ospedale ogni anno dovrebbe consentire un reclutamento adeguato a questo studio nel periodo di tre anni. Ciò dovrebbe garantire che lo studio sia interamente fattibile dal punto di vista del numero di pazienti.

Numeri di pazienti necessari per uno studio praticabile

Al momento non siamo in grado di eseguire calcoli statistici di potenza, poiché non siamo a conoscenza della sensibilità di nessuno dei due test diagnostici proposti. Il lavoro precedente di Kaye SB20., et al. ha suggerito una tecnica PCR con una sensibilità dell'82% se utilizzata nelle cornee umane). Al contrario, la tecnica PCR utilizzata qui dovrebbe avere una sensibilità molto superiore a causa dell'uso dell'analisi in tempo reale e della metodologia nidificata utilizzata. Questi test saranno confrontati con la diagnosi clinica di un oculista consulente esperto.

Accettiamo la necessità di calcoli di potenza statistica per calcolare un livello di reclutamento necessario per uno studio valido. Effettueremo quindi uno studio iniziale utilizzando tutti questi test diagnostici su 50 pazienti e i risultati di questo verranno utilizzati per eseguire calcoli di potenza utilizzando il metodo della dimensione del campione per l'equivalenza unilaterale delle sensibilità basata sul test di McNemar21 per garantire numeri adeguati vengono reclutati. Inoltre, speriamo di reclutare eccessivamente (20% in più rispetto a questo numero richiesto) per consentire l'abbandono dello studio da parte dei pazienti.

Criteri di reclutamento dei pazienti

Saranno arruolati per questo studio pazienti di età superiore ai 16 anni in cui la causa della cheratite è difficile da diagnosticare e in cui HSK deve essere escluso. Saranno esclusi i pazienti immunodepressi compresi i pazienti trattati con steroidi sistemici. A tutti i pazienti verrà chiesto il consenso verbale e scritto. Tutti i pazienti continueranno ad essere seguiti secondo le esigenze cliniche. Oltre alla valutazione di routine, verrà registrata un'ulteriore categorizzazione clinica da parte dei consulenti presenti in quei pazienti che si ritiene (a) abbiano e (b) non abbiano prove cliniche in linea con l'infezione erpetica.

Procedura diagnostica di immunofluorescenza in vivo

Saranno applicati all'occhio 30 microlitri di mAB marcato con fluorescenza (2mg/ml), (lo stesso mAB utilizzato nel precedente studio di Sharma A., et al7) in soluzione salina normale. Dopo 20 minuti l'anticorpo non legato verrà lavato via con soluzione salina. L'occhio verrà visualizzato con una lampada a fessura o un microscopio confocale in vivo, se disponibile. Verrà registrata la penetrazione di mAB attraverso gli strati della cornea. Inoltre, verrà registrata la prova dell'infiammazione stromale e notata la sua relazione con la fluorescenza specifica. Ciò indicherà il contributo dell'infezione erpetica attiva (mediante fluorescenza specifica nell'epitelio, nello stroma o in entrambi) come effetto causativo piuttosto che come risposta immunologica al virus latente.

Confronto dei risultati in vivo con la tecnica PCR annidata in tempo reale

Prima dell'applicazione dell'anticorpo verrà eseguita una citologia ad impressione per confermare la presenza/assenza di antigeni virali mediante analisi PCR in tempo reale nidificata. Il potenziale di contaminazione dell'amplicone associato all'uso del test di amplificazione dell'acido nucleico è ben riconosciuto e rende obbligatorio l'uso di (a) postazioni di lavoro separate e designate e (b) un flusso di lavoro unidirezionale dalla preparazione del campione all'analisi del prodotto amplificato; questo modello di funzionamento è standard nel laboratorio di virologia regionale. Tutti gli esperimenti di PCR saranno quindi condotti sotto la supervisione del Dr. Hugh O'Neill presso il Regional Virology Laboratory, RVH, Belfast.

I campioni di citologia per impressione saranno inviati al laboratorio in terreno di trasporto virale. Ogni campione verrà sottoposto a vortex per 15 secondi al ricevimento in laboratorio per risospendere il contenuto cellulare. Un volume verrà rimosso per la PCR e il resto verrà archiviato.

La nested PCR sarà effettuata utilizzando primer che riconoscono il gene gpD di HSV-1 (i prodotti esterni di HSV-1 saranno rispettivamente di 221 e 184 paia di basi (bp) mentre i prodotti interni saranno rispettivamente di 138 e 101 bp). La PCR hot-start verrà eseguita in un termociclatore Perkin Elmer GeneAmp 2400 con 10 μl di campione più 40 μl di miscela e sottoposto a 35 cicli di primo ciclo. Un microlitro di prodotto verrà trasferito in 49 μl di miscela di secondo ciclo per 25 cicli di secondo ciclo. I campioni di citologia per impressione prelevati da occhi non infiammati da reclute senza storia di infezione oculare erpetica verranno utilizzati come campioni negativi noti. In ogni analisi saranno inclusi anche un controllo positivo per HSV e un controllo negativo per acqua distillata. I prodotti del primo e del secondo round saranno visualizzati insieme su gel di agarosio al 2% colorati con bromuro di etidio e fotografati (Polaroid). Bande di dimensioni appropriate presenti solo al secondo round, o presenti sia al primo che al secondo round, saranno registrate rispettivamente come positive e fortemente positive. Tutti i campioni positivi verranno testati nuovamente.

Il personale di laboratorio responsabile del test PCR non sarà a conoscenza dei risultati del test anticorpale in vivo. Verrà effettuato un confronto tra la sensibilità e la specificità dell'anticorpo monoclonale in vivo e la diagnosi di nested real time PCR.

Indagare l'effetto di mAB sull'ambiente infiammatorio della superficie oculare L'analisi del profilo generale delle citochine sarà valutata anche monitorando il profilo delle citochine delle lacrime in due diversi momenti: prima del trattamento con anticorpi monoclonali e di nuovo 30 minuti dopo l'applicazione dell'anticorpo. Il profilo citochinico delle lacrime sarà analizzato utilizzando la proteomica con un biochip proteico (RANDOX Labs. Ltd.) in grado di rilevare quantitativamente simultaneamente una serie di citochine pro e antinfiammatorie. I campioni di lacrime di pazienti sospettati di infezione erpetica attiva ma che non hanno ricevuto anticorpi serviranno come controlli. Tale analisi consentirà di formulare dichiarazioni in merito alla potenziale reazione infiammatoria/immunologica all'anticorpo monoclonale.

Indagare su una potenziale reazione immunologica sistemica il mAB del topo Verranno prelevati dieci millilitri di sangue coagulato prima dell'applicazione dell'anticorpo monoclonale per testare la presenza di anticorpo preesistente. Inoltre, al controllo di 3 mesi verranno prelevati altri 10 millilitri di sangue e analizzati nuovamente per gli anticorpi che potrebbero essersi formati nell'interfaccia di tre mesi dopo l'applicazione del monoclonale alla cornea.

Si ritiene che la cornea avascolare sia un sito immunologicamente privilegiato, rendendo meno probabile il potenziale di una risposta immunitaria all'anticorpo.