Die Wirksamkeit zweier potenzieller diagnostischer Assays für Herpes-simplex-Keratitis (HSK)

Strategie

Patienten, die die ophthalmologischen Abteilungen besuchen und die Kriterien erfüllen, die unten in den Kriterien für die Patientenrekrutierung aufgeführt sind, werden um eine schriftliche Zustimmung gebeten, sich freiwillig an dieser Studie zu beteiligen. Tränen werden entfernt und bis zur weiteren Analyse in einem sterilen, gekennzeichneten Eppendorf bei -70 °C gelagert. Aus der entzündeten Hornhaut wird eine Abdruck-Zytologieprobe entnommen und in einem viralen Transportmedium aufbewahrt und zur Extraktion und Lagerung an das regionale Virologielabor in Belfast geschickt. Blutproben werden entnommen und entsprechend gelagert, bis die gepaarten 3-Monats-Proben für Antikörpertests verfügbar sind. Monoklonale Antikörper werden für die In-vivo-Diagnose von HSK wie unten beschrieben angewendet und unter Verwendung eines konfokalen In-vivo-Mikroskops betrachtet. Für jeden Patienten wird ein fotografischer Nachweis des Ergebnisses aufgezeichnet. Die Daten für die eingebettete Echtzeit-PCR-Analyse und den monoklonalen Antikörpertest werden im Verlauf der Studie für jeden Patienten von verschiedenen Personen separat erfasst. Die Patientenakten werden im Verlauf der Studie auch mit den Ergebnissen der Tränen- und Bluttests aktualisiert.

Rekrutierungspotential:

Über 200 Augenpatienten im RVH Belfast, über 300 Patienten in Bedford und über 600 Patienten im BMEC in Birmingham werden jedes Jahr mit topischem Aciclovir bei Verdacht auf eine HSV-1-Infektion behandelt. Die Zahl der hausärztlich behandelten Patienten in der Gemeinde würde diese Zahl deutlich erhöhen. Die überwiegende Mehrheit dieser Patienten wird nie eine Laborbestätigung einer herpetischen Infektion gehabt haben. Der Patientendurchsatz in jedem Krankenhaus pro Jahr sollte eine angemessene Rekrutierung für diese Studie über den Zeitraum von drei Jahren ermöglichen. Damit soll sichergestellt werden, dass die Studie aus Sicht der Patientenzahlen absolut tragfähig ist.

Für eine tragfähige Studie benötigte Patientenzahlen

Derzeit sind wir nicht in der Lage, statistische Power-Berechnungen durchzuführen, da uns die Sensitivität der beiden vorgeschlagenen diagnostischen Assays nicht bekannt ist. Frühere Arbeiten von Kaye SB20., et al. haben eine PCR-Technik mit einer Sensitivität von 82 % vorgeschlagen, wenn sie in menschlicher Hornhaut verwendet wird). Im Gegensatz dazu sollte die hier verwendete PCR-Technik aufgrund der Verwendung von Echtzeitanalyse und der verwendeten verschachtelten Methodik eine viel bessere Empfindlichkeit aufweisen. Diese Tests werden mit der klinischen Diagnose eines erfahrenen Augenarztes verglichen.

Wir akzeptieren die Notwendigkeit statistischer Power-Berechnungen, um ein für eine gültige Studie erforderliches Rekrutierungsniveau zu berechnen. Wir werden daher eine erste Studie mit allen diesen diagnostischen Assays an 50 Patienten durchführen und die Ergebnisse daraus verwenden, um Power-Berechnungen mit der Stichprobengrößenmethode für einseitige Äquivalenz von Sensitivitäten basierend auf dem McNemar-Test21 durchzuführen, um eine ausreichende Anzahl sicherzustellen rekrutiert werden. Darüber hinaus hoffen wir auf eine Überrekrutierung (20 % über dieser erforderlichen Zahl), um Patienten einen Studienabbruch zu ermöglichen.

Patientenrekrutierungskriterien

Patienten über 16 Jahre, bei denen die Ursache der Keratitis schwer zu diagnostizieren ist und bei denen eine HSK ausgeschlossen werden muss, werden in diese Studie aufgenommen. Immunsupprimierte Patienten, einschließlich Patienten, die mit systemischen Steroiden behandelt werden, werden ausgeschlossen. Alle Patienten werden um mündliche und schriftliche Zustimmung gebeten. Alle Patienten werden weiterhin gemäß den klinischen Anforderungen überwacht. Zusätzlich zur routinemäßigen Beurteilung wird eine zusätzliche klinische Kategorisierung durch die behandelnden Ärzte in die Patienten, von denen angenommen wird, dass sie (a) und (b) keine klinischen Anzeichen für eine herpetische Infektion haben, aufgezeichnet.

In-vivo-Immunfluoreszenz-Diagnoseverfahren

30 Mikroliter fluoreszenzmarkierter mAB (2 mg/ml) (derselbe mAB wie in der vorherigen Studie von Sharma A., et al.7 verwendet) in normaler Kochsalzlösung werden auf das Auge aufgetragen. Nach 20 Minuten werden ungebundene Antikörper mit Kochsalzlösung weggespült. Das Auge wird mit einer Spaltlampe oder einem konfokalen In-vivo-Mikroskop, falls verfügbar, betrachtet. Das Durchdringen der mAB durch die Hornhautschichten wird aufgezeichnet. Darüber hinaus werden Anzeichen einer Stromaentzündung aufgezeichnet und ihre Beziehung zu spezifischer Fluoreszenz notiert. Dies zeigt eher den Beitrag einer aktiven Herpesinfektion (durch spezifische Fluoreszenz entweder im Epithel, im Stroma oder in beiden) als eine ursächliche Wirkung als eine immunologische Reaktion auf ein latentes Virus an.

Vergleich von In-vivo-Ergebnissen mit verschachtelter Echtzeit-PCR-Technik

Vor dem Auftragen des Antikörpers wird eine Impressionszytologie durchgeführt, um das Vorhandensein/Fehlen von viralen Antigenen mittels verschachtelter Echtzeit-PCR-Analyse zu bestätigen. Das Potenzial für eine Amplikonkontamination im Zusammenhang mit der Verwendung von Nukleinsäureamplifikationstests ist allgemein bekannt und macht die Verwendung von (a) separaten, ausgewiesenen Arbeitsstationen und (b) einem unidirektionalen Arbeitsablauf von der Probenvorbereitung bis zur amplifizierten Produktanalyse obligatorisch; Dieses Betriebsmodell ist im regionalen Virologielabor Standard. Alle PCR-Experimente werden daher unter der Aufsicht von Dr. Hugh O'Neill im Regional Virology Laboratory, RVH, Belfast, durchgeführt.

Impressionszytologieproben werden in viralem Transportmedium an das Labor gesendet. Jede Probe wird nach Eingang im Labor 15 Sekunden lang gevortext, um den Zellinhalt zu resuspendieren. Ein Volumen wird für die PCR entnommen und der Rest wird gelagert.

Nested-PCR wird unter Verwendung von Primern durchgeführt, die das HSV-1-gpD-Gen erkennen (die HSV-1-Außenprodukte sind 221 und 184 Basenpaare (bp) groß, während die Innenprodukte 138 bzw. 101 bp groß sind). Die Hot-Start-PCR wird in einem GeneAmp 2400-Thermocycler von Perkin Elmer mit 10 μl Probe plus 40 μl Mischung durchgeführt und 35 Zyklen der ersten Runde unterzogen. Ein Mikroliter des Produkts wird für 25 Zyklen der zweiten Runde in 49 μl Mischung der zweiten Runde überführt. Impressionszytologieproben, die von nicht entzündeten Augen von Rekruten ohne Vorgeschichte einer herpetischen Augeninfektion entnommen wurden, werden als bekannt negative Proben verwendet. Eine positive HSV-Kontrolle und eine Negativkontrolle mit destilliertem Wasser werden ebenfalls in jeden Lauf eingeschlossen. Die Produkte der ersten und zweiten Runde werden zusammen auf mit Ethidiumbromid gefärbten 2%igen Agarosegelen sichtbar gemacht und fotografiert (Polaroid). Angemessen große Banden, die nur in der zweiten Runde oder sowohl in der ersten als auch in der zweiten Runde vorhanden sind, werden als positiv bzw. stark positiv aufgezeichnet. Alle positiven Proben werden erneut getestet.

Das für den PCR-Test verantwortliche Laborpersonal kennt die Ergebnisse des In-vivo-Antikörpertests nicht. Es wird ein Vergleich zwischen der Sensitivität und Spezifität des monoklonalen Antikörper-In-vivo-Assays und der verschachtelten Echtzeit-PCR-Diagnose durchgeführt.

Untersuchung der Wirkung von mAB auf das entzündliche Milieu der Augenoberfläche Die Analyse des allgemeinen Zytokinprofils wird auch bewertet, indem das Zytokinprofil von Tränen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten überwacht wird: vor der Behandlung mit monoklonalen Antikörpern und erneut 30 Minuten nach der Anwendung des Antikörpers. Das Zytokinprofil von Tränen wird mithilfe von Proteomik mit einem Proteinbiochip (RANDOX Labs. Ltd.), das zum gleichzeitigen quantitativen Nachweis einer Reihe von entzündungsfördernden und entzündungshemmenden Zytokinen geeignet ist. Tränenproben von Patienten mit Verdacht auf aktive Herpesinfektion, die aber keine Antikörper erhalten haben, dienen als Kontrollen. Eine solche Analyse erlaubt Aussagen über die mögliche entzündliche/immunologische Reaktion auf den monoklonalen Antikörper.

Untersuchung einer möglichen systemischen immunologischen Reaktion des Maus-mAb Vor der Anwendung des monoklonalen Antikörpers werden zehn Milliliter geronnenes Blut entnommen, um auf das Vorhandensein von bereits vorhandenen Antikörpern zu testen. Darüber hinaus werden bei der 3-Monats-Kontrolle weitere 10 Milliliter Blut entnommen und erneut auf Antikörper untersucht, die sich möglicherweise in der 3-Monats-Grenzfläche nach dem Auftragen des monoklonalen Arzneimittels auf die Hornhaut gebildet haben.

Es wird angenommen, dass die avaskuläre Hornhaut eine immunologisch privilegierte Stelle ist, was das Potenzial einer Immunantwort auf den Antikörper weniger wahrscheinlich macht.