Effektiviteten af ​​to potentielle diagnostiske analyser for Herpes Simplex Keratitis (HSK)

Strategi

Patienter, der går på oftalmologiske afdelinger, og som opfylder kriterierne som skitseret nedenfor i patientrekrutteringskriterier, vil blive bedt om skriftligt samtykke til at melde sig frivilligt til denne undersøgelse. Tårer vil blive fjernet og opbevaret i en steril mærket eppendorf ved -70 grader C indtil videre analyse. En aftrykscytologisk prøve vil blive taget fra den betændte hornhinde og opbevaret i viralt transportmedium og sendt til det regionale virologiske laboratorium, Belfast til ekstraktions- og opbevaringsprocedurer. Blodprøver vil blive taget og opbevaret korrekt, indtil de parrede 3 måneders prøver er tilgængelige til antistoftestning. Monoklonalt antistof vil blive anvendt til in vivo diagnosen af ​​HSK som skitseret nedenfor og set ved hjælp af et in vivo konfokalt mikroskop. Fotografisk bevis for resultatet vil blive registreret for hver patient. Data for den indlejrede realtids-PCR-analyse og den monoklonale antistoftest vil blive registreret separat af forskellige individer for hver patient, efterhånden som undersøgelsen skrider frem. Patientjournaler vil også blive opdateret med resultaterne af tåre- og blodprøverne, efterhånden som undersøgelsen skrider frem.

Rekrutteringspotentiale:

Over 200 øjenpatienter i RVH Belfast, over 300 patienter i Bedford og over 600 patienter i BMEC i Birmingham behandles hvert år med topisk acyclovir for mistanke om HSV-1-infektion. Antallet af patienter, der behandles i samfundet af praktiserende læger, ville øge dette antal markant. Langt de fleste af disse patienter vil aldrig have haft nogen laboratoriebekræftelse af herpetisk infektion. Patientgennemstrømningen gennem hvert hospital hvert år bør muliggøre tilstrækkelig rekruttering til denne undersøgelse i løbet af treårsperioden. Dette skulle sikre, at undersøgelsen er fuldstændig levedygtig set ud fra patientantallet.

Patienttal nødvendige for en levedygtig undersøgelse

På nuværende tidspunkt er vi ikke i stand til at udføre statistiske effektberegninger, da vi ikke er opmærksomme på følsomheden af ​​nogen af ​​de to foreslåede diagnostiske assays. Tidligere arbejde af Kaye SB20., et al. har foreslået en PCR-teknik med en følsomhed på 82%, når den anvendes i humane hornhinder). I modsætning hertil bør PCR-teknikken, der anvendes her, have en meget overlegen følsomhed på grund af brugen af ​​realtidsanalyse og den anvendte indlejrede metode. Disse tests vil blive sammenlignet med den kliniske diagnose af en erfaren konsulterende øjenlæge.

Vi accepterer behovet for statistiske styrkeberegninger for at beregne et rekrutteringsniveau, der er nødvendigt for en valid undersøgelse. Vi vil derfor udføre en indledende undersøgelse med alle disse diagnostiske assays på 50 patienter, og resultaterne herfra vil blive brugt til at udføre effektberegninger ved hjælp af prøvestørrelsesmetoden til ensidig ækvivalens af følsomheder baseret på McNemars test21 for at sikre tilstrækkelige tal er rekrutteret. Derudover håber vi at overrekruttere (20 % over dette krævede antal) for at give mulighed for patientfrafald fra undersøgelsen.

Kriterier for patientrekruttering

Patienter over 16 år, hvor årsagen til keratitis er svær at diagnosticere, og hvor HSK skal udelukkes, vil blive tilmeldt denne undersøgelse. Immunsupprimerede patienter inklusive patienter behandlet med systemiske steroider vil blive udelukket. Alle patienter vil blive bedt om mundtligt og skriftligt samtykke. Alle patienter vil fortsat blive fulgt i henhold til de kliniske krav. Ud over rutinevurderingen vil yderligere klinisk kategorisering af de behandlende konsulenter i de patienter, som menes at (a) har og (b) ikke har, kliniske beviser i overensstemmelse med herpetisk infektion.

In vivo immunfluorescensdiagnostisk procedure

30 mikroliter fluorescerende-mærket mAB (2mg/ml), (samme mAB som brugt i den tidligere undersøgelse af Sharma A., et al.7) i normal saltvandsopløsning vil blive påført øjet. Efter 20 minutter vil ubundet antistof blive skyllet væk med saltvandsopløsning. Øjet vil blive set med en spaltelampe eller et in vivo konfokalt mikroskop, hvis det er tilgængeligt. mAB-penetration gennem hornhindens lag vil blive registreret. Derudover vil beviser for stromal inflammation blive registreret og dets forhold til specifik fluorescens noteret. Dette vil indikere bidraget af aktiv herpetisk infektion (ved specifik fluorescens i enten epitel, stroma eller begge dele) som en forårsagende virkning snarere end et immunologisk respons på latent virus.

Sammenligning af in vivo-resultater med indlejret realtids-PCR-teknik

Impressionscytologi vil blive udført, før påføringen af ​​antistoffet, for at bekræfte tilstedeværelsen/fraværet af virale antigener ved brug af nestet real-time PCR-analyse. Potentialet for amplikonkontaminering forbundet med brug af nukleinsyreamplifikationstest er velkendt og gør brugen af ​​(a) separate, udpegede arbejdsstationer og (b) en ensrettet arbejdsgang fra prøveforberedelse til amplificeret produktanalyse obligatorisk; denne driftsmodel er standard i det regionale virologiske laboratorium. Alle PCR-forsøg vil derfor blive udført under opsyn af Dr. Hugh O'Neill i Regional Virology Laboratory, RVH, Belfast.

Impressionscytologiske prøver vil blive sendt til laboratoriet i viralt transportmedium. Hver prøve vortexes i 15 sekunder ved modtagelse i laboratoriet for at resuspendere celleindholdet. Et volumen vil blive fjernet til PCR, og resten vil blive gemt.

Nested PCR vil blive udført ved hjælp af primere, der genkender HSV-1 gpD-genet (HSV-1 ydre produkter vil være 221 og 184 basepar (bp), mens de indre produkter vil være henholdsvis 138 og 101 bp). Hot-start PCR vil blive udført i en Perkin Elmer GeneAmp 2400 termisk cyklus med 10 μl prøve plus 40 μl blanding og udsat for 35 første runde cyklusser. En mikroliter produkt vil blive overført til 49 μl anden runde blanding i 25 anden runde cyklusser. Impressionscytologiske prøver taget fra ikke-betændte øjne fra rekrutter uden historie med herpetisk øjeninfektion vil blive brugt som kendte negative prøver. En positiv HSV-kontrol og en negativ kontrol med destilleret vand vil også blive inkluderet i hver kørsel. Første og anden runde produkter vil blive visualiseret sammen på ethidiumbromid-farvede 2% agarose geler og fotograferet (Polaroid). Bånd af passende størrelse, der kun er til stede på anden runde, eller til stede på både første og anden runde, vil blive registreret som henholdsvis positive og stærke positive. Alle positive prøver vil blive testet igen.

Laboratoriepersonale, der er ansvarlige for PCR-testen, vil ikke være bekendt med resultaterne fra in vivo-antistoftesten. Sammenligning vil blive foretaget mellem sensitiviteten og specificiteten af ​​det monoklonale antistof in vivo assay og den indlejrede real-time PCR-diagnose.

Undersøgelse af effekten af ​​mAB på det okulære overflade-inflammatoriske miljø Analyse af den generelle cytokinprofil vil også blive vurderet ved at monitorere cytokinprofilen af ​​tårer på to forskellige tidspunkter: før monoklonalt antistofbehandling og igen 30 minutter efter påføring af antistoffet. Cytokinprofil af tårer vil blive analyseret ved hjælp af proteomics med en proteinbiochip (RANDOX Labs. Ltd.) i stand til samtidig kvantitativ påvisning af en række pro- og anti-inflammatoriske cytokiner. Riveprøver fra patienter, der mistænkes for aktiv herpetisk infektion, men som ikke har modtaget antistof, vil tjene som kontroller. En sådan analyse vil tillade udsagn om den potentielle inflammatoriske/immunologiske reaktion på det monoklonale antistof.

Ved at undersøge en potentiel systemisk immunologisk reaktion vil musen mAB Ti milliliter størknet blod blive taget før påføringen af ​​det monoklonale antistof for at teste for tilstedeværelsen af ​​allerede eksisterende antistof. Derudover vil der ved 3-måneders kontrol blive taget yderligere 10 milliliter blod og analyseres igen for antistoffer, som kan være dannet i 3-måneders grænsefladen efter påføring af monoklonal til hornhinden.

Den avaskulære hornhinde menes at være et immunologisk privilegeret sted, hvilket gør potentialet for et immunrespons på antistoffet mindre sandsynligt.