La eficacia de dos posibles ensayos de diagnóstico para la queratitis por herpes simple (HSK)

Estrategia

A los pacientes que asisten a los departamentos de Oftalmología, que cumplan con los criterios que se describen a continuación en los criterios de reclutamiento de pacientes, se les pedirá su consentimiento por escrito para participar como voluntarios en este estudio. Las lágrimas se retirarán y almacenarán en un eppendorf estéril etiquetado a -70 grados C hasta su posterior análisis. Se tomará una muestra de citología de impresión de la córnea inflamada y se almacenará en un medio de transporte viral y se enviará al laboratorio regional de virología de Belfast para los procedimientos de extracción y almacenamiento. Se tomarán muestras de sangre y se almacenarán adecuadamente hasta que las muestras emparejadas de 3 meses estén disponibles para la prueba de anticuerpos. Se aplicarán anticuerpos monoclonales para el diagnóstico in vivo de HSK como se describe a continuación y se observarán con un microscopio confocal in vivo. La evidencia fotográfica del resultado se registrará para cada paciente. Los datos para el análisis de PCR en tiempo real anidado y la prueba de anticuerpos monoclonales serán registrados por separado por diferentes personas para cada paciente a medida que avanza el estudio. Los registros de los pacientes también se actualizarán con los resultados de los análisis de sangre y lágrimas a medida que avanza el estudio.

Potencial de reclutamiento:

Más de 200 pacientes oftalmológicos en RVH Belfast, más de 300 pacientes en Bedford y más de 600 pacientes en BMEC en Birmingham son tratados cada año con aciclovir tópico por sospecha de infección por HSV-1. El número de pacientes tratados dentro de la comunidad por médicos de cabecera aumentaría significativamente este número. La gran mayoría de estos pacientes nunca habrán tenido ninguna confirmación de laboratorio de infección herpética. El flujo de pacientes a través de cada hospital cada año debería permitir el reclutamiento adecuado para este estudio durante el período de tres años. Esto debería garantizar que el estudio sea completamente viable desde la perspectiva del número de pacientes.

Números de pacientes necesarios para un estudio viable

En la actualidad, no podemos realizar cálculos de poder estadístico, ya que no conocemos la sensibilidad de ninguno de los dos ensayos de diagnóstico propuestos. El trabajo anterior de Kaye SB20., et al sugirió una técnica de PCR con una sensibilidad del 82% cuando se usa en córneas humanas). Por el contrario, la técnica de PCR utilizada aquí debería tener una sensibilidad muy superior debido al uso de análisis en tiempo real y la metodología anidada utilizada. Estas pruebas se compararán con el diagnóstico clínico de un oftalmólogo consultor experimentado.

Aceptamos la necesidad de cálculos de poder estadístico para calcular el nivel de reclutamiento necesario para un estudio válido. Por lo tanto, llevaremos a cabo un estudio inicial usando todos estos ensayos de diagnóstico en 50 pacientes y los resultados de este se usarán para realizar cálculos de poder usando el método de tamaño de muestra para la equivalencia unilateral de sensibilidades basada en la prueba de McNemar21 para asegurar números adecuados son reclutados. Además, esperamos sobre reclutar (20% por encima de este número requerido) para permitir el abandono del estudio por parte de los pacientes.

Criterios de reclutamiento de pacientes

Se incluirán en este estudio pacientes mayores de 16 años en los que la causa de la queratitis sea difícil de diagnosticar y en los que se deba excluir HSK. Se excluirán los pacientes inmunodeprimidos, incluidos los pacientes tratados con esteroides sistémicos. A todos los pacientes se les pedirá su consentimiento verbal y escrito. Todos los pacientes seguirán siendo seguidos de acuerdo con los requisitos clínicos. Además de la evaluación de rutina, se registrará la categorización clínica adicional por parte de los consultores asistentes en aquellos pacientes que se cree que (a) tienen y (b) no tienen, evidencia clínica de acuerdo con la infección herpética.

Procedimiento de diagnóstico por inmunofluorescencia in vivo

Se aplicarán en el ojo 30 microlitros de mAB marcado con fluorescencia (2 mg/ml), (el mismo mAB que se usó en el estudio anterior de Sharma A., et al7) en solución salina normal. Después de 20 minutos, el anticuerpo no unido se enjuagará con solución salina. El ojo se observará con una lámpara de hendidura o un microscopio confocal in vivo, si está disponible. Se registrará la penetración de mAB a través de las capas de la córnea. Además, se registrará la evidencia de inflamación del estroma y se observará su relación con la fluorescencia específica. Esto indicará la contribución de la infección herpética activa (mediante fluorescencia específica en el epitelio, el estroma o ambos) como un efecto causal en lugar de una respuesta inmunológica al virus latente.

Comparación de resultados in vivo con la técnica de PCR en tiempo real anidada

Se realizará una citología de impresión, previa a la aplicación del anticuerpo, para confirmar la presencia/ausencia de antígenos virales mediante análisis de PCR en tiempo real anidado. El potencial de contaminación por amplicón asociado con el uso de pruebas de amplificación de ácidos nucleicos es bien conocido y hace obligatorio el uso de (a) estaciones de trabajo separadas y designadas y (b) un flujo de trabajo unidireccional desde la preparación de la muestra hasta el análisis del producto amplificado; este modelo de funcionamiento es estándar en el laboratorio regional de virología. Por lo tanto, todos los experimentos de PCR se llevarán a cabo bajo la supervisión del Dr. Hugh O'Neill en el Laboratorio Regional de Virología, RVH, Belfast.

Las muestras de citología de impresión se enviarán al laboratorio en medio de transporte viral. Cada muestra se agitará durante 15 segundos al recibirla en el laboratorio para resuspender el contenido celular. Se retirará un volumen para PCR y el resto se almacenará.

La PCR anidada se llevará a cabo utilizando cebadores que reconocen el gen gpD de HSV-1 (los productos externos de HSV-1 tendrán 221 y 184 pares de bases (pb) mientras que los productos internos tendrán 138 y 101 pb, respectivamente). La PCR de inicio en caliente se realizará en un termociclador Perkin Elmer GeneAmp 2400 con 10 μl de muestra más 40 μl de mezcla y se someterá a 35 ciclos de primera ronda. Se transferirá un microlitro de producto a 49 μl de mezcla de segunda ronda durante 25 ciclos de segunda ronda. Las muestras de citología de impresión tomadas de ojos no inflamados de reclutas sin antecedentes de infección ocular herpética se utilizarán como muestras negativas conocidas. También se incluirán en cada ejecución un control positivo de HSV y un control negativo de agua destilada. Los productos de primera y segunda ronda se visualizarán juntos en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio y se fotografiarán (Polaroid). Las bandas de tamaño apropiado presentes solo en la segunda ronda, o presentes tanto en la primera como en la segunda ronda, se registrarán como positivas y positivas fuertes, respectivamente. Todas las muestras positivas se volverán a analizar.

El personal de laboratorio responsable de la prueba PCR no estará al tanto de los resultados de la prueba de anticuerpos in vivo. Se realizará una comparación entre la sensibilidad y la especificidad del ensayo in vivo de anticuerpos monoclonales y el diagnóstico de PCR en tiempo real anidado.

Investigación del efecto de mAB en el medio inflamatorio de la superficie ocular El análisis del perfil general de citoquinas también se evaluará mediante el control del perfil de citoquinas de las lágrimas en dos momentos diferentes: antes del tratamiento con anticuerpos monoclonales y nuevamente 30 minutos después de la aplicación del anticuerpo. El perfil de citocinas de las lágrimas se analizará mediante proteómica con un biochip de proteínas (RANDOX Labs. Ltd.) capaz de detección cuantitativa simultánea de una serie de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Las muestras de lágrimas de pacientes con sospecha de infección herpética activa pero que no han recibido anticuerpos servirán como controles. Tal análisis permitirá que se hagan declaraciones con respecto a la posible reacción inflamatoria/inmunológica al anticuerpo monoclonal.

Investigación de una reacción inmunológica sistémica potencial Se tomarán diez mililitros de sangre coagulada antes de la aplicación del anticuerpo monoclonal para detectar la presencia de anticuerpos preexistentes. Además, en la revisión de los 3 meses, se tomarán otros 10 mililitros de sangre y se analizarán de nuevo en busca de anticuerpos que puedan haberse formado en la interfaz de tres meses después de la aplicación del monoclonal en la córnea.

Se cree que la córnea avascular es un sitio inmunológicamente privilegiado, lo que hace que la posibilidad de una respuesta inmunitaria al anticuerpo sea menos probable.