Skuteczność dwóch potencjalnych testów diagnostycznych dla opryszczkowego zapalenia rogówki (HSK)

Strategia

Pacjenci oddziałów okulistycznych, którzy spełniają kryteria określone poniżej w kryteriach rekrutacji pacjentów, zostaną poproszeni o pisemną zgodę na zgłoszenie się na ochotnika do tego badania. Łzy zostaną usunięte i przechowywane w sterylnym oznakowanym eppendorfie w -70 stopniach C do dalszej analizy. Z rogówki objętej stanem zapalnym zostanie pobrana próbka do cytologii wyciskowej, przechowywana w wirusowym podłożu transportowym i wysyłana do regionalnego laboratorium wirusologicznego w Belfaście w celu ekstrakcji i przechowywania. Próbki krwi będą pobierane i odpowiednio przechowywane do czasu, aż sparowane próbki z 3 miesięcy będą dostępne do badania przeciwciał. Przeciwciało monoklonalne będzie stosowane do diagnozy HSK in vivo, jak opisano poniżej i oglądane przy użyciu mikroskopu konfokalnego in vivo. Dla każdego pacjenta zostanie zarejestrowana dokumentacja fotograficzna wyniku. Dane do zagnieżdżonej analizy PCR w czasie rzeczywistym i testu przeciwciał monoklonalnych będą rejestrowane oddzielnie przez różne osoby dla każdego pacjenta w miarę postępu badania. Dane pacjentów będą również aktualizowane o wyniki badań krwi i łez w miarę postępu badania.

Potencjał rekrutacyjny:

Ponad 200 pacjentów z oczami w RVH Belfast, ponad 300 pacjentów w Bedford i ponad 600 pacjentów w BMEC w Birmingham jest co roku leczonych miejscowo acyklowirem z powodu podejrzenia zakażenia HSV-1. Liczba pacjentów leczonych w środowisku przez lekarzy POZ znacząco by tę liczbę zwiększyła. Zdecydowana większość tych pacjentów nigdy nie miała żadnego laboratoryjnego potwierdzenia zakażenia opryszczką. Przepustowość pacjentów przez każdy szpital każdego roku powinna umożliwić odpowiednią rekrutację do tego badania w okresie trzech lat. Powinno to zapewnić, że badanie jest całkowicie wykonalne z punktu widzenia liczby pacjentów.

Numery pacjentów potrzebne do opłacalnego badania

Obecnie nie jesteśmy w stanie wykonać obliczeń mocy statystycznej, ponieważ nie jesteśmy świadomi czułości żadnego z dwóch proponowanych testów diagnostycznych. Wcześniejsza praca Kaye SB20. i wsp. zasugerowała technikę PCR o czułości 82%, gdy jest stosowana w ludzkich rogówkach). Natomiast zastosowana tutaj technika PCR powinna charakteryzować się znacznie wyższą czułością dzięki zastosowaniu analizy w czasie rzeczywistym i zastosowanej metodologii zagnieżdżonej. Testy te zostaną porównane z diagnozą kliniczną doświadczonego konsultanta okulisty.

Akceptujemy potrzebę obliczeń mocy statystycznej w celu obliczenia poziomu rekrutacji potrzebnego do prawidłowego badania. W związku z tym przeprowadzimy wstępne badanie z wykorzystaniem wszystkich tych testów diagnostycznych na 50 pacjentach, a wyniki tego badania zostaną wykorzystane do wykonania obliczeń mocy przy użyciu metody wielkości próby dla jednostronnej równoważności czułości w oparciu o test McNemara21 w celu zapewnienia odpowiednich liczb są rekrutowani. Ponadto mamy nadzieję na większą rekrutację (20% powyżej wymaganej liczby), aby umożliwić pacjentom rezygnację z badania.

Kryteria rekrutacji pacjentów

Pacjenci w wieku powyżej 16 lat, u których przyczyna zapalenia rogówki jest trudna do zdiagnozowania i u których należy wykluczyć HSK, zostaną włączeni do tego badania. Pacjenci z obniżoną odpornością, w tym pacjenci leczeni steroidami ogólnoustrojowymi, zostaną wykluczeni. Wszyscy pacjenci zostaną poproszeni o ustną i pisemną zgodę. Wszyscy pacjenci będą nadal obserwowani zgodnie z wymaganiami klinicznymi. Oprócz rutynowej oceny, zostanie zarejestrowana dodatkowa kategoryzacja kliniczna przez prowadzących konsultantów na tych pacjentów, u których uważa się, że (a) mają i (b) nie mają dowodów klinicznych zgodnych z infekcją opryszczką.

Procedura diagnostyki immunofluorescencyjnej in vivo

Do oka aplikuje się 30 mikrolitrów znakowanego fluorescencyjnie mAB (2 mg/ml) (tego samego mAB, które zastosowano w poprzednim badaniu Sharmy A. i wsp.7) w normalnym roztworze soli fizjologicznej. Po 20 minutach niezwiązane przeciwciało zostanie wypłukane roztworem soli fizjologicznej. Oko będzie oglądane za pomocą lampy szczelinowej lub mikroskopu konfokalnego in vivo, jeśli jest dostępny. Rejestrowana będzie penetracja mAB przez warstwy rogówki. Ponadto zostaną zarejestrowane dowody zapalenia podścieliska i odnotowany zostanie jego związek ze specyficzną fluorescencją. Wskaże to udział aktywnej infekcji opryszczkowej (poprzez specyficzną fluorescencję w nabłonku, zrębie lub obu) jako efekt przyczynowy, a nie odpowiedź immunologiczną na utajony wirus.

Porównanie wyników in vivo z techniką nested real time PCR

Cytologia impresyjna zostanie przeprowadzona przed zastosowaniem przeciwciała w celu potwierdzenia obecności/nieobecności antygenów wirusowych przy użyciu analizy zagnieżdżonej reakcji PCR w czasie rzeczywistym. Potencjalne zanieczyszczenie amplikonem związane z użyciem testu do amplifikacji kwasów nukleinowych jest dobrze znane i wymaga użycia (a) oddzielnych, wyznaczonych stanowisk pracy oraz (b) jednokierunkowego przepływu pracy od przygotowania próbki do analizy amplifikowanego produktu; ten model działania jest standardem w regionalnym laboratorium wirusologicznym. Dlatego wszystkie eksperymenty PCR będą przeprowadzane pod nadzorem dr Hugh O'Neill w Regionalnym Laboratorium Wirusologicznym, RVH, Belfast.

Próbki do cytologii impresyjnej zostaną przesłane do laboratorium w wirusowym podłożu transportowym. Każdą próbkę należy worteksować przez 15 sekund po dostarczeniu do laboratorium, aby ponownie zawiesić zawartość komórek. Jedna objętość zostanie usunięta do PCR, a pozostała część będzie przechowywana.

Nested PCR zostanie przeprowadzony przy użyciu starterów rozpoznających gen gpD HSV-1 (zewnętrzne produkty HSV-1 będą miały 221 i 184 par zasad (pz), podczas gdy produkty wewnętrzne będą miały odpowiednio 138 i 101 pz). PCR z gorącym startem zostanie przeprowadzona w termocyklerze Perkin Elmer GeneAmp 2400 z 10 μl próbki plus 40 μl mieszanki i poddana 35 pierwszym cyklom. Jeden mikrolitr produktu zostanie przeniesiony do 49 μl mieszanki drugiej rundy na 25 cykli drugiej rundy. Próbki cytologiczne wyciskowe pobrane z oczu bez stanu zapalnego od rekrutów bez historii zakażenia opryszczką oka zostaną użyte jako znane próbki ujemne. W każdej serii będzie również uwzględniona kontrola dodatnia HSV i kontrola ujemna wody destylowanej. Produkty pierwszej i drugiej rundy zostaną razem zwizualizowane na 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny i sfotografowane (Polaroid). Prążki o odpowiedniej wielkości obecne tylko w drugiej rundzie lub obecne zarówno w pierwszej, jak i drugiej rundzie będą rejestrowane odpowiednio jako dodatnie i silnie dodatnie. Wszystkie pozytywne próbki zostaną ponownie przebadane.

Personel laboratorium odpowiedzialny za test PCR nie będzie świadomy wyników testu na przeciwciała in vivo. Dokonane zostanie porównanie pomiędzy czułością i specyficznością przeciwciała monoklonalnego w teście in vivo i diagnostyką zagnieżdżonej PCR w czasie rzeczywistym.

Badanie wpływu mAB na środowisko zapalne powierzchni oka Analiza ogólnego profilu cytokin będzie również oceniana przez monitorowanie profilu cytokin łez w dwóch różnych punktach czasowych: przed leczeniem przeciwciałem monoklonalnym i ponownie 30 minut po zastosowaniu przeciwciała. Profil cytokin we łzach zostanie przeanalizowany przy użyciu proteomiki z biochipem białkowym (RANDOX Labs. Ltd.) zdolne do jednoczesnego ilościowego wykrywania szeregu cytokin pro- i przeciwzapalnych. Próbki łez pobrane od pacjentów podejrzanych o aktywną infekcję opryszczkową, którzy nie otrzymali przeciwciał, będą służyć jako kontrole. Taka analiza pozwoli na sformułowanie stwierdzeń dotyczących potencjalnej reakcji zapalnej/immunologicznej na przeciwciało monoklonalne.

Badanie potencjalnej ogólnoustrojowej reakcji immunologicznej mysie mAB Pobiera się dziesięć mililitrów skrzepniętej krwi przed zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego w celu zbadania obecności wcześniej istniejącego przeciwciała. Ponadto podczas kontroli po 3 miesiącach zostanie pobrane kolejne 10 mililitrów krwi i ponownie przeanalizowane pod kątem przeciwciał, które mogły powstać w trzymiesięcznym interfejsie po nałożeniu monoklonalnego na rogówkę.

Uważa się, że pozbawiona unaczynienia rogówka jest miejscem uprzywilejowanym immunologicznie, co zmniejsza prawdopodobieństwo potencjalnej odpowiedzi immunologicznej na przeciwciało.