Účinnost dvou potenciálních diagnostických testů na herpes simplex keratitis (HSK)

Strategie

Pacienti navštěvující oftalmologická oddělení, kteří splňují kritéria uvedená níže v kritériích pro nábor pacientů, budou požádáni o písemný souhlas s dobrovolnou účastí v této studii. Slzy budou odstraněny a uloženy ve sterilním označeném eppendorfu při -70 °C až do další analýzy. Vzorek otiskové cytologie bude odebrán ze zanícené rohovky a uložen ve virovém transportním médiu a odeslán do regionální virologické laboratoře v Belfastu k extrakci a skladování. Vzorky krve budou odebrány a vhodně uloženy, dokud nebudou spárované 3měsíční vzorky k dispozici pro testování protilátek. Monoklonální protilátka bude aplikována pro in vivo diagnózu HSK, jak je uvedeno níže, a prohlížena pomocí in vivo konfokálního mikroskopu. U každého pacienta bude zaznamenán fotografický důkaz výsledku. Data pro vnořenou analýzu PCR v reálném čase a test monoklonálních protilátek budou zaznamenávat odděleně různými jedinci pro každého pacienta v průběhu studie. Záznamy pacientů budou také aktualizovány s výsledky testů slz a krve v průběhu studie.

Náborový potenciál:

Více než 200 očních pacientů v RVH Belfast, více než 300 pacientů v Bedfordu a více než 600 pacientů v BMEC v Birminghamu je každý rok léčeno topickým acyklovirem pro podezření na infekci HSV-1. Počet pacientů ošetřených v rámci komunity praktickými lékaři by toto číslo výrazně zvýšil. Naprostá většina těchto pacientů nikdy neměla žádné laboratorní potvrzení herpetické infekce. Průchod pacientů v každé nemocnici každý rok by měl umožnit adekvátní nábor do této studie po dobu tří let. To by mělo zajistit, že studie bude plně životaschopná z hlediska počtu pacientů.

Počty pacientů potřebné pro životaschopnou studii

V současné době nejsme schopni provádět statistické výpočty síly, protože si nejsme vědomi citlivosti žádné ze dvou navrhovaných diagnostických metod. Předchozí práce Kaye SB20., et al. navrhla techniku ​​PCR s citlivostí 82 % při použití v lidských rohovkách). Na rozdíl od toho by zde použitá technika PCR měla mít mnohem vyšší citlivost díky použití analýzy v reálném čase a použité vnořené metodologie. Tyto testy budou porovnány s klinickou diagnózou zkušeného oftalmologa.

Přijímáme potřebu statistických výpočtů síly, abychom vypočítali úroveň náboru potřebnou pro platnou studii. Provedeme proto úvodní studii za použití všech těchto diagnostických testů na 50 pacientech a výsledky z ní budou použity k provedení výpočtů výkonu s použitím metody velikosti vzorku pro jednostrannou ekvivalenci citlivostí na základě McNemarova testu21, abychom zajistili adekvátní počty jsou rekrutováni. Kromě toho doufáme, že překročíme nábor (20 % nad tento požadovaný počet), abychom umožnili vyřazení pacientů ze studie.

Kritéria pro nábor pacientů

Do této studie budou zařazeni pacienti starší 16 let, u kterých je obtížné diagnostikovat příčinu keratitidy au kterých je nutné vyloučit HSK. Imunosuprimovaní pacienti včetně pacientů léčených systémovými steroidy budou vyloučeni. Všichni pacienti budou požádáni o ústní a písemný souhlas. Všichni pacienti budou nadále sledováni podle klinických požadavků. Kromě rutinního hodnocení bude zaznamenávána další klinická kategorizace ošetřujícími konzultanty na pacienty, o kterých se předpokládá, že (a) mají a (b) nemají klinické důkazy v souladu s herpetickou infekcí.

In vivo imunofluorescenční diagnostický postup

Do oka bude aplikováno 30 mikrolitrů fluorescenčně značené mAB (2 mg/ml), (stejná mAB, jaká byla použita v předchozí studii Sharma A., et al7) v normálním fyziologickém roztoku. Po 20 minutách se nenavázaná protilátka opláchne fyziologickým roztokem. Oko bude pozorováno štěrbinovou lampou nebo in vivo konfokálním mikroskopem, pokud je k dispozici. Bude zaznamenána penetrace mAB vrstvami rohovky. Kromě toho bude zaznamenán důkaz stromálního zánětu a zaznamenán jeho vztah ke specifické fluorescenci. To bude indikovat příspěvek aktivní herpetické infekce (specifickou fluorescencí buď v epitelu, stromatu nebo v obou) jako kauzativní účinek spíše než imunologická odpověď na latentní virus.

Porovnání výsledků in vivo s technikou nested real time PCR

Před aplikací protilátky bude provedena otiskovací cytologie, aby se potvrdila přítomnost/nepřítomnost virových antigenů pomocí vnořené analýzy PCR v reálném čase. Potenciál kontaminace amplikonem spojený s použitím testu amplifikace nukleové kyseliny je dobře znám a vyžaduje použití (a) samostatných, určených pracovních stanic a (b) jednosměrný pracovní postup od přípravy vzorku po analýzu amplifikovaného produktu; tento model provozu je v krajské virologické laboratoři standardní. Všechny PCR experimenty budou proto prováděny pod dohledem Dr. Hugha O'Neilla v Regionální virologické laboratoři, RVH, Belfast.

Vzorky otiskové cytologie budou odeslány do laboratoře ve virovém transportním médiu. Každý vzorek bude po přijetí do laboratoře vortexován po dobu 15 sekund, aby se resuspendoval buněčný obsah. Objem bude odebrán pro PCR a zbytek bude uložen.

Nested PCR bude prováděna s použitím primerů rozpoznávajících gen HSV-1 gpD (vnější produkty HSV-1 budou mít 221 a 184 párů bází (bp), zatímco vnitřní produkty budou mít 138 a 101 bp). Hot-start PCR bude provedena v tepelném cykléru Perkin Elmer GeneAmp 2400 s 10 μl vzorku plus 40 μl směsi a podrobena 35 prvním cyklům. Jeden mikrolitr produktu se přenese do 49 μl směsi druhého kola na 25 cyklů druhého kola. Vzorky otiskové cytologie odebrané z nezanícených očí rekrutů bez anamnézy herpetické oční infekce budou použity jako známé negativní vzorky. Pozitivní kontrola HSV a negativní kontrola z destilované vody budou také zahrnuty do každého běhu. Produkty prvního a druhého kola budou společně vizualizovány na 2% agarózových gelech obarvených ethidium bromidem a vyfotografovány (Polaroid). Pásy odpovídající velikosti přítomné pouze ve druhém kole nebo přítomné v prvním a druhém kole budou zaznamenány jako pozitivní a silně pozitivní. Všechny pozitivní vzorky budou znovu testovány.

Zaměstnanci laboratoře odpovědní za PCR test nebudou znát výsledky in vivo testu na protilátky. Bude provedeno srovnání mezi senzitivitou a specificitou in vivo testu monoklonální protilátky a vnořenou diagnózou PCR v reálném čase.

Zkoumání účinku mAB na zánětlivé prostředí očního povrchu Analýza obecného cytokinového profilu bude také hodnocena sledováním cytokinového profilu slz ve dvou různých časových bodech: před léčbou monoklonální protilátkou a znovu 30 minut po aplikaci protilátky. Cytokinový profil slz bude analyzován pomocí proteomiky s proteinovým biočipem (RANDOX Labs. Ltd.) schopné současné kvantitativní detekce řady pro- a protizánětlivých cytokinů. Vzorky slz od pacientů s podezřením na aktivní herpetickou infekci, kteří však nedostali protilátky, budou sloužit jako kontroly. Taková analýza umožní učinit prohlášení týkající se potenciální zánětlivé/imunologické reakce na monoklonální protilátku.

Zkoumání potenciální systémové imunologické reakce myší mAB Před aplikací monoklonální protilátky bude odebráno deset mililitrů sražené krve k testování přítomnosti již existující protilátky. Kromě toho bude při 3měsíční kontrole odebráno dalších 10 mililitrů krve a znovu analyzováno na protilátky, které se mohly vytvořit na rozhraní tří měsíců po aplikaci monoklonální látky na rohovku.

Předpokládá se, že avaskulární rohovka je imunologicky privilegovaným místem, takže potenciál imunitní odpovědi na protilátku je méně pravděpodobný.