점막 IgE 반응의 기본이 되는 면역학적 기전

작업 패키지 1 이론적 근거: CRSwNP 환자의 비강 및 비용종에서 국소적으로 높은 수준의 IgE가 검출될 수 있습니다. NP에서 생성된 다반응성 IgE의 높은 수준을 고려하면 NP IgE 반응이 알레르기 IgE B 세포 반응과 어떻게 다른지 추측하는 것은 흥미로울 것입니다. 이를 위해서는 두 환경 모두에서 IgE 생산 B 세포로 이어지는 메커니즘에 대한 고해상도 분석이 필요하지만 현재까지 수행되지 않았습니다.

마일스톤 1.1: CRSwNP 및 알레르기성 비염에서 IgE B 세포 틈새를 완전히 특성화하기 위해 연구자들은 HDM 알레르기가 있는 25명의 CRSwNP, 25명의 CRSsNP 및 25명의 알레르기성 비염 환자로부터 여러 샘플을 수집할 것입니다. 또한, 전신 면역 반응의 대용으로 편도선 생검이 수집됩니다. IgE 수치가 높은 5명의 HDM 알레르기 환자로부터 비강 조직(하갑개)과 편도선 생검을 분리하고 이들 조직을 IgE B 세포 틈새의 철저한 특성화에 적용했습니다.

마일스톤 1.2: 이 이정표에서 연구자들은 IgE B 세포 반응에 대한 매우 상세한 지도와 이것이 CRSwNP 및 알레르기성 비염의 2형 틈새 시장에서 어떻게 관리되는지를 얻기 위해 착수할 것입니다. 이를 위해 우리는 10x 유전체학 5'VDJ seq 프로토콜에 대한 비강 폴립, 열등한 콘차 및 편도선 조직의 고해상도 단일 세포 맵을 생성할 것입니다. B 세포 하위 집합과 면역 수용체 프로필에 대한 고해상도 지도를 작성함으로써 연구자들은 만성 2형 IgE B 세포 반응이 비알레르기성 및 알레르기성 2형 질병에서 어떻게 통제되고 추진되는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 이 분석을 위해 DALI(Digital Adressable Lighting Interface) 생물정보학 소프트웨어 패키지가 사용됩니다. 여기서 연구자들은 배중심 반응을 통해 또는 난포외 반응에서 순수 B 세포로부터 직접 IgE+ 형질아세포 또는 형질세포 클론의 기원을 추적하는 것을 구체적으로 목표로 삼을 것입니다. 또한, NicheNet 분석을 통해 다른 면역 세포나 구조 세포와 같은 IgE B 세포 반응의 조절인자를 검출할 수 있습니다. 이 소프트웨어 도구는 차등 유전자 발현 및 선별된 수용체-리간드 목록을 기반으로 사이토카인, 케모카인 및 세포 리간드에 대한 잠재적인 송신자-수신자 쌍을 분석합니다.

작업 패키지 2: CRSwNP 환자의 비강 분비물과 조직에서 높은 수준의 다반응성 IgE가 검출될 수 있지만, IgE로의 클래스 스위치 재조합이 항원에 의해 유발되는지 아니면 손상 관련 요인에 의해 유발되는지는 확실하지 않습니다.

마일스톤 2.1: 현재까지 NP에서 IgE의 특성은 여전히 ​​수수께끼로 남아 있지만 이러한 IgE는 질병 생물학에서의 역할을 이해하는 데 핵심입니다. NP IgE의 특성을 규명하기 위해 조사자는 CRSwNP 환자 5명으로부터 각각 20개의 단클론 IgE 항체를 생성할 것이며, 마찬가지로 알레르기 비염 환자 5명으로부터 각각 20개의 단클론 IgE 항체를 생성할 것입니다. 이를 통해 IgE+ 클론의 전체 길이 중쇄 및 경쇄 서열이 검색되고 이를 재조합 단일클론 항체로 생산하게 됩니다. 또한, NP IgE 항체는 다반응성을 평가하여 여러 항원에 결합할 수 있도록 하며, 이는 소위 천연 IgE에 기인하는 특징입니다.

마일스톤 2.2: 연구자들은 비강 프로테옴에 대한 편견 없는 분석을 수행함으로써 IgE B 세포 반응을 조절하는 국소 요인에 대한 새로운 통찰력을 얻는 것을 목표로 합니다. 최첨단 단일 세포 분석 방법과 결합하여 이러한 전체적인 관점을 취함으로써 팀은 조절 장애가 있는 미생물군집 또는 광범위한 조직 손상과의 상호 작용이 IgE B 세포 반응을 유도하는 데 어떤 역할을 하는지 처음으로 밝혀낼 수 있을 것입니다. . 동일한 환자의 비강 분비물 샘플에 대해 편견 없는 샷건 MS/MS 질량 분석을 수행하여 비강 단백질체를 분석합니다. 비강 단백질체에 대한 이러한 분석을 통해 우리는 국소 IgE 반응을 유발할 수 있는 요인에 대해 편견 없는 시각을 얻을 수 있습니다.

마일스톤 2.3: 비용종에서 IgE 클래스 스위치 재조합이 어떻게 유도되는지 기계적으로 이해하기 위해 상피 세포인 PBMC(말초 혈액 단핵 세포) 공동 배양을 설정하고 이러한 배양에서 IgE 클래스 스위치 재조합을 유도합니다. CRSwNP 또는 알레르기성 비염 환자의 첫 번째 상피 세포는 확장되어 각 기증자의 PBMC와 공기-액체-계면(ALI) 공동 배양에 배치됩니다. 먼저, 팀은 PBMC-상피 세포 공동 배양에 IL-33(전형적인 알라민)을 추가하여 IgE 클래스 스위치 재조합에 대한 상피 손상 효과를 모방하는 것부터 시작할 것입니다. 다음으로, 이러한 배양물은 황색 포도상구균(CRSwNP 환자의 비강에 흔히 서식하는 박테리아 계통) 또는 칸디다 알비칸스(CRSwNP 환자의 비강에 서식하는 곰팡이)와 함께 배양됩니다. 마지막으로 연구자들은 후자 요인들의 다양한 조합을 테스트할 것입니다. 이러한 배양에서 다색 유세포 분석법에 의한 배중심 B 세포 반응(IgG1+ 및 IgE+ CD20+BCL6+), 형질 모세포(IgG1+ 및 IgE+CD20+CD138+) 및 형질 세포(IgG1 및 IgE+CD20-CD138+)의 유도는 다음과 같습니다. 평가되었습니다. 이러한 실험은 관련 유발 요인에 대한 비용종 또는 알레르기성 비염 환자의 상피 세포 지시가 B 세포의 IgE 클래스 전환에 어떻게 영향을 미치는지 설명할 것입니다. 티

작업 페이지 3: 국소 IgE B 세포 반응 조절에 대한 Dupilumab의 효과 평가 이론적 근거: Dupilumab은 IgE 클래스 전환의 주요 상류 조절자를 표적으로 삼으므로 연구자는 Dupilumab 치료 시 IgE 선택 메커니즘에 차이가 있는지 여부를 다룰 것입니다.

마일스톤 3.1: Dupilumab에 의한 CRSwNP의 IgE B 세포 반응의 국소 조절 평가 Dupilumab이 국소 IgE 조절에 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위해 Dupilumab 치료 CRSwNP 환자 5명으로부터 샘플을 수집합니다. 여기서는 Dupilumab 치료가 국소 IgE 생산에 영향을 미쳤는지 여부를 확인하기 위해 코 분비물 내 총 IgE 수준을 분석할 것입니다. 분자 면역학적 메커니즘을 밝히기 위해 Dupilumab 치료를 받은 환자의 대상 비용종 조직에서 단일 세포 VDJ 서열을 분석하고 작업 페이지 2에서 얻은 데이터와 비교하여 IL-4에 대한 클론성 IgE 반응에 변화가 있는지 확인합니다. /IL-13 차단. 작업 패키지 2에 설명된 유사한 분석에서 작업 패키지 2에 설명된 대로 상피 세포-PBMC 공동 배양을 설정하고 배양 배지에 dupilumab을 추가하여 IL-4/-13 신호 전달을 차단합니다. 여기서는 유세포 분석을 통해 IgE B 세포 반응에 미치는 영향을 평가할 것입니다.