Imunologické mechanismy, které jsou základem mukózních IgE odpovědí

Pracovní balíček 1 Odůvodnění: U pacientů s CRSwNP lze lokálně detekovat vysoké hladiny IgE v nosní dutině a nosních polypech. Vzhledem k vysokým hladinám polyreaktivních IgE generovaných v NP je zajímavé spekulovat, jak se reakce NP IgE liší od alergických reakcí IgE B buněk. K tomu je zapotřebí analýza mechanismů vedoucích k IgE produkujícím B-buňkám v obou případech s vysokým rozlišením, ale dosud nebyla provedena.

Milník 1.1: Aby bylo možné plně charakterizovat IgE B buněčnou niku u CRSwNP a alergické rýmy, výzkumníci shromáždí několik vzorků od 25 CRSwNP, 25 CRSsNP a 25 pacientů s alergickou rýmou s alergií na HDM. Kromě toho budou shromažďovány biopsie mandlí jako proxy pro systémové imunitní odpovědi. Od 5 pacientů s alergií na HDM s vysokými hladinami IgE byly izolovány biopsie nosní tkáně (dolní skořepa) a tonzil a tyto tkáně byly podrobeny důkladné charakterizaci niky IgE B buněk.

Milník 1.2: V tomto milníku se výzkumníci zaměří na získání vysoce podrobné mapy IgE B buněčných odpovědí a toho, jak jsou řízeny ve výklenku typu 2 u CRSwNP a alergické rýmy. Za tímto účelem vygenerujeme jednobuněčnou mapu nosního polypu, dolní lastury a tkáně mandlí s vysokým rozlišením na 10x genomický 5'VDJ seq protokol. Vytvořením mapy s vysokým rozlišením podskupin B lymfocytů a jejich profilů imunitních receptorů se výzkumníci snaží porozumět tomu, jak se řídí a řídí chronické reakce B lymfocytů IgE typu 2 u nealergického a alergického onemocnění typu 2. Pro tuto analýzu bude použit bioinformatický softwarový balík DALI (Digital Adressable lighting Interface). Výzkumníci se zde konkrétně zaměří na sledování původu IgE+ plazmablastů nebo klonů plazmatických buněk prostřednictvím odpovědí germinálních center nebo přímo z naivních B buněk v extrafolikulárních odpovědích. Kromě toho analýza NicheNet umožní detekci regulátorů reakcí IgE B buněk, jako jsou jiné imunitní buňky nebo strukturální buňky. Tento softwarový nástroj analyzuje potenciální páry odesílatel-přijímač pro cytokiny, chemokiny a buněčné ligandy na základě diferenciální genové exprese a seznamů kurovaných receptor-ligand.

Pracovní balíček 2: Zatímco vysoké hladiny polyreaktivního IgE lze detekovat v nosních sekretech a tkáních pacientů s CRSwNP, není jasné, zda je rekombinace přesmyku třídy na IgE řízena antigenem nebo faktory souvisejícími s poškozením.

Milník 2.1: K dnešnímu dni zůstávají charakteristiky IgE u NP záhadné, přesto jsou tyto IgE klíčové pro pochopení jejich role v biologii onemocnění. K objasnění charakteristik NP IgE vyšetřovatelé vytvoří 20 monoklonálních IgE protilátek od každého z 5 pacientů s CRSwNP a podobně bude vytvořeno 20 monoklonálních IgE protilátek od každého z 5 pacientů s alergickou rýmou. Tímto způsobem budou získány sekvence těžkého a lehkého řetězce v plné délce klonů IgE+ a tyto budou produkovány jako rekombinantní monoklonální protilátky. Kromě toho bude hodnocena polyreaktivita NP IgE protilátek, která je činí schopnými vázat se na několik antigenů, což je vlastnost, která je připisována tzv. přirozenému IgE.

Milník 2.2: Provedením nezaujaté analýzy proteomu nosní dutiny se výzkumníci snaží získat nové poznatky o místních faktorech, které regulují odpovědi IgE B buněk. Díky tomuto holistickému pohledu v kombinaci s nejmodernějšími metodami analýzy jednotlivých buněk bude tým poprvé schopen odhalit, jakou roli hraje souhra s dysregulovaným mikrobiomem nebo rozsáhlým poškozením tkáně při řízení reakcí IgE B buněk. . Analýza proteomu nosní dutiny provedením nestranné brokovnicové MS/MS hmotnostní spektrometrie na vzorcích nosního sekretu od stejných pacientů. Tato analýza proteomu nosní dutiny nám umožní získat nezaujatý pohled na faktory, které mohou řídit lokální IgE odpovědi.

Milník 2.3: K mechanickému pochopení toho, jak je v nosních polypech indukována rekombinace IgE třídy přesmyku, založte kokultury epiteliálních buněk – PBMC (peripheral Blood Mononuclear Cells) a indukujte v těchto kulturách rekombinaci přepínače třídy IgE. První epiteliální buňky od pacientů s CRSwNP nebo alergickou rinitidou budou expandovány a vloženy do kokultivace vzduch-liquid-interface (ALI) s PBMC od příslušných dárců. Nejprve tým začne napodobováním účinku poškození epitelu na rekombinaci změny třídy IgE přidáním IL-33 (typický alarmin) do kokultur PBMC-epiteliálních buněk. Dále budou tyto kultury inkubovány se Staphylococcus aureus (kmen bakterií často kolonizující nosní dutinu pacientů s CRSwNP) nebo Candida albicans (houba často kolonizující nosní dutinu pacientů s CRSwNP). Nakonec vyšetřovatelé otestují různé kombinace posledně jmenovaných faktorů. V těchto kulturách bude indukce B buněčných odpovědí zárodečných center (IgG1+ a IgE+ CD20+BCL6+), plazmatických blastů (IgG1+ a IgE+CD20+CD138+) a plazmatických buněk (IgG1 a IgE+CD20-CD138+) vícebarevnou průtokovou cytometrií. posuzovat. Tyto experimenty objasní, jak instrukce epitelu pacientů s nosním polypem nebo alergickou rýmou na relevantní spouštěče ovlivňují změnu třídy IgE v B buňkách. T

Pracovní stránka 3: Posouzení účinku Dupilumabu na modulaci lokálních IgE B buněčných odpovědí Odůvodnění: Jelikož se Dupilumab zaměřuje na klíčové upstream regulátory přepínání tříd IgE, vyšetřovatelé budou řešit, zda existují nějaké rozdíly v mechanismech selekce IgE při léčbě dupilumabem.

Milník 3.1: Hodnocení lokální modulace IgE B buněčných odpovědí u CRSwNP dupilumabem Aby bylo možné otestovat, zda dupilumab ovlivňuje regulaci lokálního IgE, budou odebrány vzorky od 5 pacientů s CRSwNP léčených Dupilumabem. Zde budou analyzovány celkové hladiny IgE v nosním sekretu, abychom viděli, zda u těchto pacientů léčba dupilumabem ovlivnila lokální produkci IgE. Pro objasnění molekulárně imunologických mechanismů bude předmětná tkáň nosních polypů pacientů léčených Dupilumabem analyzována na jednobuněčné VDJ seq a porovnána s daty získanými na pracovní straně 2 a zjistí se, zda existují nějaké změny v klonálních IgE odpovědích na IL-4 /IL-13 blokování. V podobném testu, jak je popsáno v pracovním balíčku 2, připravíme společné kultury epiteliálních buněk a PBMC, jak je vysvětleno v pracovním balíčku 2, a zablokujeme signalizaci IL-4/-13 přidáním dupilumabu do kultivačního média. Zde budeme hodnotit účinek na IgE B buněčnou odpověď pomocí průtokové cytometrie.