Immunologische Mechanismen, die mukosalen IgE-Reaktionen zugrunde liegen

Arbeitspaket 1 Begründung: Hohe IgE-Werte können lokal in der Nasenhöhle und in Nasenpolypen von Patienten mit CRSwNP nachgewiesen werden. Angesichts der hohen Mengen an polyreaktivem IgE, die in NP erzeugt werden, ist es interessant zu spekulieren, wie sich NP-IgE-Reaktionen von allergischen IgE-B-Zell-Reaktionen unterscheiden. Hierzu ist eine hochauflösende Analyse der Mechanismen erforderlich, die in beiden Situationen zur IgE-produzierenden B-Zellen führen, die jedoch bisher noch nicht durchgeführt wurde.

Meilenstein 1.1: Um die IgE-B-Zell-Nische bei CRSwNP und allergischer Rhinitis vollständig zu charakterisieren, werden die Forscher mehrere Proben von 25 CRSwNP-, 25 CRSsNP- und 25 allergischen Rhinitis-Patienten mit HDM-Allergie sammeln. Darüber hinaus werden Mandelbiopsien als Indikator für systemische Immunantworten gesammelt. Von 5 HDM-allergischen Patienten mit hohem IgE-Spiegel wurden Nasengewebe (untere Concha) und Tonsillenbiopsien isoliert und diese Gewebe einer gründlichen Charakterisierung der IgE-B-Zell-Nische unterzogen.

Meilenstein 1.2: In diesem Meilenstein wollen die Forscher eine detaillierte Karte der IgE-B-Zell-Reaktionen und ihrer Steuerung in der Typ-2-Nische bei CRSwNP und allergischer Rhinitis erstellen. Zu diesem Zweck werden wir eine hochauflösende Einzelzellkarte des Nasenpolypen, der unteren Muschel und des Tonsillengewebes gemäß dem 10x-Genomik-5'VDJ-Seq-Protokoll erstellen. Durch die Erstellung einer hochauflösenden Karte der B-Zell-Untergruppen und ihrer Immunrezeptorprofile wollen die Forscher verstehen, wie chronische Typ-2-IgE-B-Zell-Reaktionen bei nichtallergischen und allergischen Typ-2-Erkrankungen gesteuert und gesteuert werden. Für diese Analyse wird das bioinformatische Softwarepaket DALI (Digital Adressable Lighting Interface) verwendet. Die Forscher werden hier insbesondere darauf abzielen, die Ursprünge von IgE+-Plasmablasten oder Plasmazellklonen durch Keimzentrumsreaktionen oder direkt von naiven B-Zellen in extrafollikulären Reaktionen zu verfolgen. Darüber hinaus ermöglicht die NicheNet-Analyse die Erkennung von Regulatoren von IgE-B-Zell-Antworten, wie z. B. anderen Immunzellen oder Strukturzellen. Dieses Softwaretool analysiert potenzielle Sender-Empfänger-Paare für Zytokine, Chemokine und zelluläre Liganden auf der Grundlage der differentiellen Genexpression und kuratierter Rezeptor-Liganden-Listen.

Arbeitspaket 2: Während in Nasensekret und Gewebe von Patienten mit CRSwNP hohe Mengen an polyreaktivem IgE nachgewiesen werden können, ist unklar, ob die Klassenwechsel-Rekombination zu IgE durch Antigene oder durch schädigungsassoziierte Faktoren gesteuert wird.

Meilenstein 2.1: Bis heute bleiben die Eigenschaften von IgE in NP rätselhaft, dennoch sind diese IgE von entscheidender Bedeutung, um ihre Rolle in der Krankheitsbiologie zu verstehen. Um die Eigenschaften von NP-IgE aufzuklären, werden die Forscher 20 monoklonale IgE-Antikörper von jedem der 5 Patienten mit CRSwNP erzeugen, und ebenso werden 20 monoklonale IgE-Antikörper von jedem der 5 Patienten mit allergischer Rhinitis erzeugt. Dadurch werden die vollständigen schweren und leichten Kettensequenzen von IgE+-Klonen gewonnen und diese als rekombinante monoklonale Antikörper produziert. Darüber hinaus wird die Polyreaktivität von NP-IgE-Antikörpern untersucht, die es ihnen ermöglicht, an mehrere Antigene zu binden, eine Eigenschaft, die dem sogenannten natürlichen IgE zugeschrieben wird.

Meilenstein 2.2: Durch die Durchführung einer unvoreingenommenen Analyse des Proteoms der Nasenhöhle wollen die Forscher neue Erkenntnisse über die lokalen Faktoren gewinnen, die die IgE-B-Zell-Reaktionen regulieren. Durch diese ganzheitliche Sichtweise in Kombination mit modernsten Methoden der Einzelzellanalyse wird das Team erstmals in der Lage sein, herauszufinden, welche Rolle das Zusammenspiel mit einem fehlregulierten Mikrobiom oder einer ausgedehnten Gewebeschädigung bei der Auslösung von IgE-B-Zell-Reaktionen spielt . Die Analyse des Proteoms der Nasenhöhle durch Durchführung einer unvoreingenommenen Shotgun-MS/MS-Massenspektrometrie an Nasensekretproben derselben Patienten. Diese Analyse des Proteoms der Nasenhöhle wird es uns ermöglichen, einen unvoreingenommenen Überblick über die Faktoren zu erhalten, die lokale IgE-Reaktionen auslösen könnten.

Meilenstein 2.3: Um mechanistisch zu verstehen, wie die IgE-Klassenwechsel-Rekombination in Nasenpolypen induziert wird, wird eine Epithelzelle – PBMC (periphere mononukleäre Blutzellen) – kokultiviert und in diesen Kulturen eine IgE-Klassenwechsel-Rekombination induziert. Erste Epithelzellen von Patienten mit CRSwNP oder allergischer Rhinitis werden expandiert und mit PBMC der jeweiligen Spender in eine Air-Liquid-Interface (ALI)-Kokultur gebracht. Zunächst wird das Team damit beginnen, die Auswirkung von Epithelschäden auf die Rekombination von IgE-Klassenschaltern nachzuahmen, indem es IL-33 (ein typisches Alarmin) zu den PBMC-Epithelzell-Kokulturen hinzufügt. Anschließend werden diese Kulturen mit Staphylococcus aureus (einem Bakterienstamm, der häufig die Nasenhöhle von CRSwNP-Patienten besiedelt) oder Candida albicans (einem Pilz, der häufig die Nasenhöhle von CRSwNP-Patienten besiedelt) inkubiert. Abschließend werden die Forscher verschiedene Kombinationen der letztgenannten Faktoren testen. In diesen Kulturen erfolgt die Induktion von B-Zell-Reaktionen im Keimzentrum (IgG1+ und IgE+ CD20+BCL6+), Plasmablasten (IgG1+ und IgE+CD20+CD138+) und Plasmazellen (IgG1 und IgE+CD20-CD138+) mittels mehrfarbiger Durchflusszytometrie beurteilt. Diese Experimente werden klären, wie sich die Anweisung des Epithels von Patienten mit Nasenpolypen oder allergischer Rhinitis auf relevante Auslöser auf den IgE-Klassenwechsel in B-Zellen auswirkt. T

Arbeitsseite 3: Bewertung der Wirkung von Dupilumab auf die Modulation lokaler IgE-B-Zell-Reaktionen Begründung: Da Dupilumab auf die wichtigsten vorgelagerten Regulatoren des IgE-Klassenwechsels abzielt, werden die Forscher untersuchen, ob Unterschiede in den Mechanismen der IgE-Auswahl bei der Behandlung mit Dupilumab bestehen.

Meilenstein 3.1: Bewertung der lokalen Modulation von IgE-B-Zell-Reaktionen in CRSwNP durch Dupilumab Um zu testen, ob Dupilumab die Regulierung von lokalem IgE beeinflusst, werden Proben von 5 mit Dupilumab behandelten CRSwNP-Patienten gesammelt. Hier wird der Gesamt-IgE-Spiegel im Nasensekret analysiert, um zu sehen, ob bei diesen Patienten die Behandlung mit Dupilumab die lokale IgE-Produktion beeinflusst. Zur Aufklärung der molekularen immunologischen Mechanismen wird das vorliegende Nasenpolypengewebe von Patienten unter Dupilumab-Behandlung auf Einzelzell-VDJ-Seq analysiert und mit den in Arbeitsseite 2 erhaltenen Daten verglichen, um zu sehen, ob es Veränderungen in den klonalen IgE-Reaktionen auf IL-4 gibt /IL-13-Blockierung. In einem ähnlichen Assay wie in Arbeitspaket 2 beschrieben, werden wir Epithelzellen-PBMC-Kokulturen aufbauen, wie in Arbeitspaket 2 erläutert, und die IL-4/-13-Signalübertragung durch Zugabe von Dupilumab zum Kulturmedium blockieren. Wir werden hier die Auswirkung auf IgE-B-Zell-Reaktionen mittels Durchflusszytometrie bewerten.