Immunologiske mekanismer, der ligger til grund for slimhinde-IgE-responser

Arbejdspakke 1 Begrundelse: Høje niveauer af IgE kan påvises lokalt i næsehulen og næsepolypper fra patienter med CRSwNP. I betragtning af de høje niveauer af polyreaktivt IgE genereret i NP, er det spændende at spekulere i, hvordan NP IgE-responser adskiller sig fra allergiske IgE B-celleresponser. Til dette kræves en højopløsningsanalyse af mekanismerne, der fører til IgE-producerende B-celler i begge indstillinger, men den er til dato ikke blevet udført.

Milepæl 1.1: For fuldt ud at karakterisere IgE B-cellenichen i CRSwNP og allergisk rhinitis, vil efterforskerne indsamle flere prøver fra 25 CRSwNP-, 25 CRSsNP- og 25 allergiske rhinitispatienter med HDM-allergi. Derudover vil der blive indsamlet tonsilbiopsier som en proxy for systemiske immunresponser. Fra 5 HDM-allergiske patienter med høje IgE-niveauer blev næsevæv (inferior concha) og tonsilbiopsier isoleret og udsat disse væv for grundig karakterisering af IgE B-cellenichen.

Milepæl 1.2: I denne milepæl vil efterforskerne sætte sig for at opnå et detaljeret kort over IgE B-celleresponser, og hvordan de styres i type2-nichen i CRSwNP og allergisk rhinitis. Til dette formål vil vi generere et enkeltcellekort i høj opløsning af næsepolyp, inferior concha og tonsilvæv til 10x genomics 5'VDJ seq protokol. Ved at skabe et højopløsningskort over B-celle-undergrupperne og deres immunreceptorprofiler, sigter efterforskerne på at forstå, hvordan kroniske type2 IgE B-celleresponser styres og drives i ikke-allergisk og allergisk type 2-sygdom. Til denne analyse vil DALI (Digital Adressable Lighting Interface) bioinformatisk softwarepakke blive brugt. Efterforskerne vil her specifikt sigte mod at spore oprindelsen af ​​IgE+ plasmablast eller plasmacellekloner gennem germinale centerresponser eller direkte fra naive B-celler i ekstrafollikulære responser. Derudover vil NicheNet-analyse give mulighed for påvisning af regulatorer af IgE B-celleresponser, såsom andre immunceller eller strukturelle celler. Dette softwareværktøj analyserer potentielle sender-modtager-par for cytokiner, kemokiner og cellulære ligander, baseret på differentiel genekspression og kurerede receptor-ligand-lister.

Arbejdspakke 2: Mens høje niveauer af polyreaktivt IgE kan påvises i nasale sekreter og væv hos patienter med CRSwNP, er det uklart, om klasseskiftrekombination til IgE er drevet af antigen eller af skadesassocierede faktorer.

Milepæl 2.1: Til dato forbliver karakteristikaene af IgE i NP gådefulde, men alligevel er disse IgE'er nøglen til at forstå deres rolle i sygdomsbiologi. For at belyse karakteristikaene af NP IgE vil efterforskerne generere 20 monoklonale IgE-antistoffer fra hver af 5 patienter med CRSwNP, og tilsvarende vil 20 monoklonale IgE-antistoffer fra hver af 5 patienter med allergisk rhinitis blive genereret. Herved vil de tunge og lette kæde-sekvenser i fuld længde af IgE+-kloner blive hentet og få disse produceret som rekombinante monoklonale antistoffer. Derudover vil NP IgE-antistoffer besidder polyreaktivitet blive vurderet, hvilket gør dem i stand til at binde til flere antigener, en egenskab, der er blevet tilskrevet såkaldt naturligt IgE.

Milepæl 2.2: Ved at udføre en objektiv analyse af proteomet i næsehulen sigter efterforskerne på at opnå ny indsigt i de lokale faktorer, der regulerer IgE B-celleresponser. Ved at anlægge dette holistiske syn i kombination med avancerede enkeltcelleanalysemetoder vil teamet for første gang være i stand til at afdække, hvordan samspil med et dysreguleret mikrobiom eller omfattende vævsskader spiller en rolle i at drive IgE B-celleresponser . Analyse af næsehuleproteomet ved at udføre upartisk haglgevær MS/MS massespektrometri på næsesekretionsprøver fra de samme patienter. Denne analyse af næsehulens proteom vil give os mulighed for at få et upartisk billede af de faktorer, der kan drive lokale IgE-responser.

Milepæl 2.3: For mekanistisk at forstå, hvordan IgE-klasse switch-rekombination induceres i næsepolypper, opretter man en epitelcelle - PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) cokulturer og inducerer IgE-klasse switch-rekombination i disse kulturer. De første epitelceller fra patienter fra CRSwNP eller allergisk rhinitis vil blive udvidet og sat i air-liquid-interface (ALI) co-kultur med PBMC fra de respektive donorer. Først vil holdet starte med at efterligne effekten af ​​epitelbeskadigelse på IgE-klasse switch-rekombination ved at tilføje IL-33 (et typisk alarmin) til PBMC-epitelcelle-cokulturerne. Dernæst vil disse kulturer inkuberes med Staphylococcus aureus (en bakteriestamme, der ofte koloniserer næsehulen hos CRSwNP-patienter) eller Candida albicans (en svamp, der ofte koloniserer næsehulen hos CRSwNP-patienter). Til sidst vil efterforskerne teste forskellige kombinationer af de sidstnævnte faktorer. I disse kulturer vil induktionen af ​​germinal center B-celleresponser (IgG1+ og IgE+ CD20+BCL6+), plasmablaster (IgG1+ og IgE+CD20+CD138+) og plasmaceller (IgG1 og IgE+CD20-CD138+) ved flerfarvet flowcytometri være vurderet. Disse eksperimenter vil belyse, hvordan instruktion fra epitelet hos patienter med næsepolyp eller allergisk rhinitis efter relevante triggere påvirker IgE-klasseskift i B-celler. T

Arbejdsside 3: Vurdering af virkningen af ​​Dupilumab på modulering af lokale IgE B-celleresponser Begrundelse: Da Dupilumab er rettet mod de vigtigste opstrømsregulatorer af IgE-klasseskift, vil efterforskerne undersøge, om der er forskelle i mekanismerne for IgE-selektion ved Dupilumab-behandling.

Milepæl 3.1: Vurdering af lokal modulering af IgE B-celleresponser i CRSwNP af Dupilumab For at teste, om Dupilumab påvirker reguleringen af ​​lokal IgE, vil der blive indsamlet prøver fra 5 Dupilumab-behandlede CRSwNP-patienter. Her vil de samlede IgE-niveauer i nasale sekretioner, for at se om Dupilumab-behandling hos disse patienter har påvirket lokal IgE-produktion blive analyseret. For at belyse de molekylære immunologiske mekanismer vil det pågældende næsepolypvæv fra patienter på Dupilumab-behandling analyseres for enkeltcellede VDJ-seq og sammenlignes med dataene opnået på arbejdsside 2, og se om der er ændringer i de klonale IgE-responser på IL-4 /IL-13 blokering. I et lignende assay som beskrevet i arbejdspakke 2 vil vi opsætte epitelcelle-PBMC cokulturer som forklaret i arbejdspakke 2 og blokere IL-4/-13 signalering ved at tilføje dupilumab i dyrkningsmediet. Vi vil her vurdere effekten på IgE B-celleresponser ved flowcytometri.