Limakalvojen IgE-vasteiden taustalla olevat immunologiset mekanismit

Työpaketti 1 Perustelut: Korkeat IgE-tasot voidaan havaita paikallisesti nenäontelossa ja nenäpolyypeissä potilailta, joilla on CRSwNP. Ottaen huomioon NP:ssä syntyvän polyreaktiivisen IgE:n korkeat tasot, on kiehtovaa spekuloida, kuinka NP IgE -vasteet eroavat allergisista IgE B -soluvasteista. Tätä varten tarvitaan korkearesoluutioinen analyysi mekanismeista, jotka johtavat IgE:tä tuottaviin B-soluihin molemmissa olosuhteissa, mutta sitä ei ole tähän mennessä tehty.

Virstanpylväs 1.1: CRSwNP:n ja allergisen nuhan IgE B-solujen markkinaraon karakterisoimiseksi täydellisesti tutkijat keräävät useita näytteitä 25 CRSwNP-, 25 CRSsNP- ja 25 allergisesta nuhapotilaasta, joilla on HDM-allergia. Lisäksi kerätään nielurisojen biopsiat systeemisten immuunivasteiden välityspalvelimena. Viidestä HDM-allergisesta potilaasta, joilla oli korkeat IgE-tasot, nenäkudos (alempi kotilo) ja nielurisojen biopsiat eristettiin ja näille kudoksille tehtiin perusteellinen IgE B-solujen markkinarako.

Virstanpylväs 1.2: Tässä virstanpylväässä tutkijat pyrkivät saamaan erittäin yksityiskohtaisen kartan IgE B -soluvasteista ja siitä, miten niitä hallitaan tyypin 2 markkinarakossa CRSwNP:ssä ja allergisessa nuhassa. Tätä tarkoitusta varten luomme korkearesoluutioisen yksisolukartan nenäpolyypistä, alemmasta simpukasta ja nielurisakudoksesta 10x genomics 5'VDJ-seq -protokollalle. Luomalla korkearesoluutioisen kartan B-solujen alaryhmistä ja niiden immuunireseptoriprofiileista tutkijat pyrkivät ymmärtämään, kuinka kroonisia tyypin 2 IgE B-soluvasteita ohjataan ja ohjataan ei-allergisissa ja allergisissa tyypin 2 taudeissa. Tässä analyysissä käytetään DALI (Digital Adressable lighting Interface) bioinformaattista ohjelmistopakettia. Tutkijat pyrkivät tässä erityisesti jäljittämään IgE+ -plasmablastien tai plasmasolukloonien alkuperät itukeskuksen vasteiden kautta tai suoraan naiiveista B-soluista follikulaarisissa vasteissa. Lisäksi NicheNet-analyysi mahdollistaa IgE B-soluvasteiden säätelijöiden, kuten muiden immuunisolujen tai rakennesolujen, havaitsemisen. Tämä ohjelmistotyökalu analysoi sytokiinien, kemokiinien ja soluligandien mahdolliset lähettäjä-vastaanotin-parit differentiaalisen geeniekspression ja kuratoitujen reseptori-ligandiluetteloiden perusteella.

Työpaketti 2: Vaikka korkeat polyreaktiivisen IgE:n tasot voidaan havaita CRSwNP-potilaiden nenäeritteissä ja kudoksissa, on epäselvää, ohjaavatko luokan vaihdon rekombinaatio IgE:ksi antigeeni vai vaurioon liittyvät tekijät.

Virstanpylväs 2.1: Tähän mennessä NP:n IgE:n ominaisuudet ovat edelleen arvoituksellisia, mutta nämä IgE:t ovat kuitenkin avainasemassa niiden roolin ymmärtämisessä sairausbiologiassa. NP IgE:n ominaisuuksien selvittämiseksi tutkijat tuottavat 20 monoklonaalista IgE-vasta-ainetta jokaisesta viidestä CRSwNP-potilaasta ja vastaavasti 20 monoklonaalista IgE-vasta-ainetta jokaisesta viidestä allergisesta nuhasta kärsivästä potilaasta. Tällä tavoin IgE+-kloonien täyspitkät raskaan ja kevyen ketjun sekvenssit haetaan ja ne tuotetaan rekombinantti monoklonaalisina vasta-aineina. Lisäksi NP-IgE-vasta-aineilla on polyreaktiivisuutta, jolloin ne kykenevät sitoutumaan useisiin antigeeneihin, mikä on ominaisuus, jonka on katsottu johtuvan niin sanotusta luonnollisesta IgE:stä.

Virstanpylväs 2.2: Suorittamalla puolueettoman analyysin nenäontelon proteomista tutkijat pyrkivät saamaan uusia näkemyksiä paikallisista tekijöistä, jotka säätelevät IgE B-soluvasteita. Ottamalla tämän kokonaisvaltaisen näkemyksen yhdessä uusimpien yksisoluanalyysimenetelmien kanssa, tiimi pystyy ensimmäistä kertaa selvittämään, kuinka vuorovaikutus säätelemättömän mikrobiomin tai laajan kudosvaurion kanssa vaikuttaa IgE B-soluvasteisiin. . Nenäontelon proteomin analyysi suorittamalla puolueeton haulikko-MS/MS-massaspektrometria samojen potilaiden nenäeritysnäytteille. Tämä nenäontelon proteomin analyysi antaa meille mahdollisuuden saada puolueeton käsitys tekijöistä, jotka saattavat aiheuttaa paikallisia IgE-vasteita.

Virstanpylväs 2.3: Ymmärtääksesi mekaanisesti, kuinka IgE-luokan vaihtorekombinaatio indusoituu nenäpolyypeissa, perusta epiteelisolu-PBMC (peripheral Blood Mononuclear Cells) yhteisviljelmät ja indusoi IgE-luokan vaihtorekombinaatio näissä viljelmissä. Ensimmäiset epiteelisolut potilailta, joilla on CRSwNP tai allerginen nuha, laajennetaan ja laitetaan ilma-neste-rajapinnan (ALI) yhteisviljelyyn vastaavien luovuttajien PBMC:n kanssa. Ensinnäkin ryhmä alkaa jäljitellä epiteelivaurion vaikutusta IgE-luokan vaihtorekombinaatioon lisäämällä IL-33:a (tyypillinen alarmiini) PBMC-epiteelisolujen yhteisviljelmiin. Seuraavaksi näitä viljelmiä inkuboidaan Staphylococcus aureuksen (bakteerikanta, joka usein kolonisoi CRSwNP-potilaiden nenäontelon) tai Candida albicansin (sieni, joka asuu usein CRSwNP-potilaiden nenäontelossa) kanssa. Lopuksi tutkijat testaavat viimeksi mainittujen tekijöiden erilaisia ​​yhdistelmiä. Näissä viljelmissä itukeskuksen B-soluvasteiden (IgG1+ ja IgE+ CD20+BCL6+), plasmablastien (IgG1+ ja IgE+CD20+CD138+) ja plasmasolujen (IgG1 ja IgE+CD20-CD138+) induktio monivärivirtaussytometrialla on arvioitu. Nämä kokeet selvittävät, kuinka nenäpolyyppi- tai allergisen nuhan potilaiden epiteelin antama ohje asiaankuuluvien laukaisimien yhteydessä vaikuttaa IgE-luokan vaihtoon B-soluissa. T

Työsivu 3: Arvioidaan Dupilumabin vaikutusta paikallisten IgE-B-soluvasteiden modulaatioon. Perustelut: Koska Dupilumabi kohdistuu IgE-luokan vaihdon tärkeimpiin ylävirran säätelijöihin, tutkijat selvittävät, onko dupilumabihoidon IgE-valinnan mekanismeissa eroja.

Virstanpylväs 3.1: Dupilumabin CRSwNP:n IgE B-soluvasteiden paikallisen modulaation arvioiminen Sen testaamiseksi, vaikuttaako dupilumabi paikallisen IgE:n säätelyyn, kerätään näytteitä viideltä Dupilumabilla hoidetusta CRSwNP-potilaasta. Tässä analysoidaan nenäeritteiden kokonais-IgE-tasot sen selvittämiseksi, vaikuttiko dupilumabihoito näillä potilailla paikalliseen IgE-tuotantoon. Molekyyli-immunologisten mekanismien selvittämiseksi Dupilumab-hoitoa saavien potilaiden nenäpolyyppikudoksesta analysoidaan yksisoluinen VDJ-seq ja verrataan työsivulla 2 saatuihin tietoihin ja katsotaan, onko klonaalisissa IgE-vasteissa muutoksia IL-4:n vaikutuksesta. /IL-13 esto. Samanlaisessa määrityksessä, kuten työpaketissa 2 on kuvattu, perustamme epiteelisolu-PBMC-yhteisviljelmiä työpaketissa 2 kuvatulla tavalla ja estämme IL-4/-13-signaloinnin lisäämällä dupilumabia viljelyalustaan. Arvioimme tässä vaikutusta IgE B -soluvasteisiin virtaussytometrian avulla.