A nyálkahártya IgE válaszai mögött meghúzódó immunológiai mechanizmusok

1. munkacsomag Indoklás: Magas IgE szint mutatható ki lokálisan az orrüregben és a CRSwNP-s betegek orrpolipjaiban. Tekintettel az NP-ben generált polireaktív IgE magas szintjére, érdekes feltételezni, hogy az NP IgE válaszok miben különböznek az allergiás IgE B sejtválaszoktól. Ehhez mindkét esetben szükség van az IgE-t termelő B-sejtekhez vezető mechanizmusok nagy felbontású elemzésére, de ezt a mai napig nem végezték el.

1.1. mérföldkő: A CRSwNP és az allergiás nátha IgE B sejtjeinek teljes jellemzésére a kutatók több mintát gyűjtenek 25 CRSwNP, 25 CRSsNP és 25 allergiás nátha HDM allergiás betegtől. Ezen túlmenően a mandulabiopsziákat a szisztémás immunválaszok proxykájaként gyűjtik. 5 HDM-allergiás betegből, akiknek magas IgE-szintje orrszövet (alsó kagyló) és mandulabiopszia volt, izoláltuk, és ezeket a szöveteket az IgE B sejtrés alapos jellemzésének vetették alá.

1.2. mérföldkő: Ebben a mérföldkőben a kutatók arra törekednek, hogy részletes térképet készítsenek az IgE B-sejtek válaszairól, és arról, hogyan szabályozzák azokat a 2-es típusú résben a CRSwNP és az allergiás rhinitis esetében. Ebből a célból nagy felbontású egysejtes térképet készítünk az orrpolipról, az alsó kagylószövetről és a mandulaszövetről a 10x genomics 5'VDJ szekvenciális protokoll szerint. A B-sejt-alcsoportok és immunreceptor-profiljaik nagy felbontású térképének elkészítésével a kutatók célja annak megértése, hogy a krónikus 2-es típusú IgE B-sejtes válaszok hogyan szabályozzák és vezérlik a nem allergiás és allergiás típusú 2-es típusú betegségekben. Ehhez az elemzéshez DALI (Digital Adressable lighting Interface) bioinformatikai szoftvercsomagot használunk. A kutatók itt kifejezetten az IgE+ plazmablaszt vagy plazmasejt klónok eredetének nyomon követésére törekednek a germinális központ válaszokon keresztül, vagy közvetlenül a naiv B-sejtekből extrafollikuláris válaszokban. Ezen túlmenően a NicheNet elemzés lehetővé teszi az IgE B sejtválaszok szabályozóinak, például más immunsejtek vagy strukturális sejtek kimutatását. Ez a szoftvereszköz elemzi a lehetséges küldő-vevő párokat citokinekre, kemokinekre és sejtligandumokra, differenciált génexpresszió és összeállított receptor-ligandum listák alapján.

2. munkacsomag: Míg a CRSwNP-ben szenvedő betegek orrváladékában és szöveteiben magas polireaktív IgE-szint mutatható ki, nem világos, hogy az osztályváltás IgE-rekombinációját antigén vagy károsodással összefüggő tényezők okozzák-e.

2.1. mérföldkő: A mai napig az IgE jellemzői az NP-ben továbbra is rejtélyesek, de ezek az IgE-k kulcsfontosságúak a betegségbiológiában betöltött szerepük megértéséhez. Az NP IgE jellemzőinek tisztázása érdekében a kutatók 20 monoklonális IgE antitestet állítanak elő mind az 5 CRSwNP-s betegből, és hasonlóképpen 20 monoklonális IgE antitestet állítanak elő mind az 5 allergiás rhinitisben szenvedő betegből. Ezáltal az IgE+ klónok teljes hosszúságú nehéz- és könnyűlánc-szekvenciáit lekérjük, és ezeket rekombináns monoklonális antitestekként állítjuk elő. Ezenkívül megvizsgálják az NP IgE antitestek polireaktivitását, ami képessé teszi őket több antigénhez kötődni, ami az úgynevezett természetes IgE-nek tulajdonítható.

2.2. mérföldkő: Az orrüreg proteomjának elfogulatlan elemzésével a kutatók új betekintést kívánnak nyerni az IgE B sejtválaszokat szabályozó helyi tényezőkbe. Ezt a holisztikus nézetet a legmodernebb egysejt-elemzési módszerekkel kombinálva a csapat először képes lesz megfejteni, hogy a szabályozatlan mikrobiómmal vagy a kiterjedt szöveti károsodással való kölcsönhatás milyen szerepet játszik az IgE B sejtválaszok előmozdításában. . Az orrüreg proteomjának elemzése torzítás nélküli sörétes MS/MS tömegspektrometriával ugyanazon betegek orrváladék mintáin. Az orrüreg proteomjának ez az elemzése lehetővé teszi számunkra, hogy elfogulatlan képet kapjunk azokról a tényezőkről, amelyek a helyi IgE válaszokat befolyásolhatják.

2.3-as mérföldkő: Annak mechanikus megértéséhez, hogy az IgE osztályváltó rekombináció miként indukálódik orrpolipokban, hozzon létre egy epiteliális sejt - PBMC (Peripheral Blood Mononukleáris sejtek) kotenyészeteket, és indukálja az IgE osztály kapcsoló rekombinációját ezekben a tenyészetekben. A CRSwNP-ben vagy allergiás rhinitisben szenvedő betegek első epiteliális sejtjeit kiterjesztik, és levegő-folyadék-interfész (ALI) kokultúrába helyezik a megfelelő donoroktól származó PBMC-vel. Először is, a csapat azzal kezdi, hogy utánozza az epiteliális károsodás hatását az IgE osztály kapcsoló rekombinációjára azáltal, hogy IL-33-at (egy tipikus alarmint) ad a PBMC-hámsejt kokultúrákhoz. Ezután ezeket a tenyészeteket Staphylococcus aureusszal (egy baktériumtörzs, amely gyakran kolonizálja a CRSwNP-s betegek orrüregét) vagy Candida albicans-szal (egy gomba, amely gyakran kolonizálja a CRSwNP-betegek orrüregét) inkubáljuk. Végül a vizsgálók az utóbbi tényezők különböző kombinációit tesztelik. Ezekben a tenyészetekben a germinális centrum B-sejt válaszok (IgG1+ és IgE+ CD20+BCL6+), plazmablasztok (IgG1+ és IgE+CD20+CD138+) és plazmasejtek (IgG1 és IgE+CD20-CD138+) indukciója többszínű áramlási citometriával történik. értékelték. Ezek a kísérletek megvilágítják, hogy az orrpolipos vagy allergiás rhinitisben szenvedő betegek epitéliumának utasításai a releváns kiváltó tényezők hatására hogyan befolyásolják a B-sejtek IgE osztályának átváltását. T

3. munkaoldal: A Dupilumab helyi IgE B-sejtes válaszreakciók modulációjára gyakorolt ​​hatásának értékelése Indoklás: Mivel a Dupilumab az IgE osztályváltás kulcsfontosságú upstream szabályozóit célozza meg, a vizsgálók megvizsgálják, hogy vannak-e különbségek az IgE szelekciós mechanizmusaiban a dupilumab-kezelés során.

3.1. mérföldkő: Az IgE B-sejt válaszok helyi modulációjának értékelése CRSwNP-ben Dupilumab által Annak tesztelésére, hogy a dupilumab befolyásolja-e a helyi IgE szabályozását, 5 Dupilumabbal kezelt CRSwNP-s betegtől mintát veszünk. Itt az orrváladék teljes IgE-szintjét elemezzük annak megállapítására, hogy ezeknél a betegeknél a dupilumab-kezelés befolyásolta-e a helyi IgE-termelést. A molekuláris immunológiai mechanizmusok tisztázása érdekében a Dupilumab-kezelésben részesülő betegek orrpolip szövetét elemzik egysejtes VDJ-szekvenciára, és összehasonlítják a 2. munkaoldalon kapott adatokkal, és megnézik, hogy az IL-4-re adott klonális IgE-válaszokban változás történik-e. /IL-13 blokkolás. A 2. munkacsomagban leírtakhoz hasonló vizsgálatban epiteliális sejt-PBMC kotenyészeteket állítunk fel a 2. munkacsomagban leírtak szerint, és blokkoljuk az IL-4/-13 jelátvitelt dupilumab hozzáadásával a táptalajhoz. Itt áramlási citometriával értékeljük az IgE B sejtválaszokra gyakorolt ​​hatást.