Meccanismi immunologici alla base delle risposte IgE della mucosa

Pacchetto di lavoro 1 Motivazione: Alti livelli di IgE possono essere rilevati localmente nella cavità nasale e nei polipi nasali di pazienti con CRSwNP. Dati gli alti livelli di IgE polireattive generate nelle NP, è interessante speculare su come le risposte delle IgE NP differiscano dalle risposte delle cellule B IgE allergiche. Per questo, è necessaria un'analisi ad alta risoluzione dei meccanismi che portano alla produzione di IgE da parte delle cellule B in entrambi i contesti, ma ad oggi non è stata eseguita.

Obiettivo 1.1: per caratterizzare completamente la nicchia delle cellule B IgE nella CRSwNP e nella rinite allergica, i ricercatori raccoglieranno più campioni da 25 pazienti con CRSwNP, 25 CRSsNP e 25 pazienti con rinite allergica con allergia HDM. Inoltre, verranno raccolte biopsie tonsillari come proxy delle risposte immunitarie sistemiche. Da 5 pazienti allergici HDM con elevati livelli di IgE, il tessuto nasale (conca inferiore) e le biopsie tonsillari hanno isolato e sottoposto questi tessuti a una caratterizzazione approfondita della nicchia delle cellule B IgE.

Traguardo 1.2: In questa tappa fondamentale, i ricercatori si proponeranno di ottenere una mappa altamente dettagliata delle risposte delle cellule B IgE e di come sono governate nella nicchia di tipo 2 nella CRSwNP e nella rinite allergica. A questo scopo, genereremo una mappa a singola cellula ad alta risoluzione del polipo nasale, della conca inferiore e del tessuto tonsillare secondo il protocollo genomico 10x 5'VDJ seq. Creando una mappa ad alta risoluzione dei sottoinsiemi di cellule B e dei loro profili di recettori immunitari, i ricercatori mirano a capire come le risposte croniche delle cellule B IgE di tipo 2 sono governate e guidate nella malattia non allergica e allergica di tipo 2. Per questa analisi verrà utilizzato il pacchetto software bioinformatico DALI (Digital Adressable lighting Interface). I ricercatori mireranno qui specificamente a tracciare le origini dei plasmablasti IgE+ o dei cloni di plasmacellule attraverso risposte del centro germinale o direttamente da cellule B naïve in risposte extrafollicolari. Inoltre, l'analisi di NicheNet consentirà l'individuazione dei regolatori delle risposte delle cellule B IgE, come altre cellule immunitarie o cellule strutturali. Questo strumento software analizza le potenziali coppie mittente-ricevitore per citochine, chemochine e ligandi cellulari, sulla base dell'espressione genica differenziale e di elenchi curati di recettori-ligandi.

Pacchetto di lavoro 2: Sebbene alti livelli di IgE polireattive possano essere rilevati nelle secrezioni nasali e nei tessuti dei pazienti con CRSwNP, non è chiaro se la ricombinazione del cambio di classe in IgE sia guidata dall'antigene o da fattori associati al danno.

Traguardo 2.1: Ad oggi, le caratteristiche delle IgE nelle NP rimangono enigmatiche, tuttavia queste IgE sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella biologia della malattia. Per chiarire le caratteristiche delle IgE NP, gli investigatori genereranno 20 anticorpi IgE monoclonali da ciascuno dei 5 pazienti con CRSwNP e allo stesso modo verranno generati 20 anticorpi IgE monoclonali da ciascuno dei 5 pazienti con rinite allergica. In questo modo, le sequenze di catene pesanti e leggere a lunghezza intera dei cloni IgE+ verranno recuperate e prodotte come anticorpi monoclonali ricombinanti. Verranno inoltre valutati gli anticorpi IgE NP che possiedono una polireattività che li rende capaci di legarsi a più antigeni, caratteristica che è stata attribuita alle cosiddette IgE naturali.

Obiettivo 2.2: eseguendo un'analisi imparziale del proteoma della cavità nasale, i ricercatori mirano a ottenere nuove informazioni sui fattori locali che regolano le risposte delle cellule B IgE. Adottando questa visione olistica in combinazione con metodi di analisi di singole cellule all'avanguardia, il team sarà per la prima volta in grado di svelare come l'interazione con un microbioma disregolato o un danno tissutale esteso svolga un ruolo nel guidare le risposte delle cellule B IgE . L'analisi del proteoma della cavità nasale mediante spettrometria di massa MS/MS shotgun imparziale su campioni di secrezione nasale degli stessi pazienti. Questa analisi del proteoma della cavità nasale ci consentirà di ottenere una visione imparziale dei fattori che potrebbero guidare le risposte IgE locali.

Obiettivo 2.3: Per comprendere meccanicamente come viene indotta la ricombinazione del cambio di classe IgE nei polipi nasali, è stato allestito un coculture di cellule epiteliali - PBMC (cellule mononucleari del sangue periferico) e indotta la ricombinazione del cambio di classe IgE in queste colture. Le prime cellule epiteliali di pazienti affetti da CRSwNP o rinite allergica verranno espanse e messe in cocoltura con interfaccia aria-liquido (ALI) con PBMC dei rispettivi donatori. Innanzitutto, il team inizierà imitando l'effetto del danno epiteliale sulla ricombinazione dello switch di classe IgE aggiungendo IL-33 (un tipico allarme) alle coculture di cellule epiteliali-PBMC. Successivamente, queste colture verranno incubate con Staphylococcus aureus (un ceppo di batteri che spesso colonizza la cavità nasale dei pazienti con CRSwNP) o Candida albicans (un fungo che spesso colonizza la cavità nasale dei pazienti con CRSwNP). Infine, i ricercatori testeranno diverse combinazioni di questi ultimi fattori. In queste colture, l'induzione delle risposte delle cellule B del centro germinale (IgG1+ e IgE+ CD20+BCL6+), dei blasti plasmatici (IgG1+ e IgE+CD20+CD138+) e delle plasmacellule (IgG1 e IgE+CD20-CD138+) mediante citometria a flusso multicolore sarà effettuata valutato. Questi esperimenti chiariranno come l'istruzione da parte dell'epitelio dei pazienti con polipi nasali o rinite allergica su fattori scatenanti rilevanti influenza il passaggio alla classe IgE nelle cellule B. T

Pagina di lavoro 3: Valutazione dell'effetto di Dupilumab sulla modulazione delle risposte delle cellule B IgE locali Fondamento: poiché Dupilumab prende di mira i principali regolatori a monte del cambio di classe IgE, i ricercatori valuteranno se esistono differenze nei meccanismi di selezione delle IgE durante il trattamento con Dupilumab.

Tappa 3.1: Valutazione della modulazione locale delle risposte delle cellule B IgE nella CRSwNP da parte di Dupilumab Per verificare se Dupilumab influenza la regolazione delle IgE locali, verranno raccolti campioni da 5 pazienti con CRSwNP trattati con Dupilumab. Qui verranno analizzati i livelli di IgE totali nelle secrezioni nasali, per vedere se in questi pazienti il ​​trattamento con Dupilumab ha influenzato la produzione locale di IgE. Per chiarire i meccanismi immunologici molecolari, il tessuto dei polipi nasali dei pazienti in trattamento con Dupilumab verrà analizzato per VDJ seq a cellula singola e confrontato con i dati ottenuti nella pagina di lavoro 2 e si vedrà se ci sono cambiamenti nelle risposte IgE clonali su IL-4 /Blocco IL-13. In un test simile a quello descritto nel pacchetto di lavoro 2, allestiremo coculture di cellule epiteliali-PBMC come spiegato nel pacchetto di lavoro 2 e bloccheremo la segnalazione di IL-4/-13 aggiungendo dupilumab nel mezzo di coltura. Valuteremo qui l'effetto sulle risposte delle cellule B IgE mediante citometria a flusso.