Mechanizmy immunologiczne leżące u podstaw odpowiedzi IgE błony śluzowej

Pakiet Zadań 1 Uzasadnienie: Wysoki poziom IgE można wykryć lokalnie w jamie nosowej i polipach nosa u pacjentów z CRSwNP. Biorąc pod uwagę wysoki poziom polireaktywnych IgE wytwarzanych w NP, intrygujące jest spekulowanie, w jaki sposób odpowiedzi NP IgE różnią się od alergicznych odpowiedzi komórek B IgE. W tym celu konieczna jest wysokorozdzielcza analiza mechanizmów prowadzących do wytwarzania IgE przez limfocyty B w obu przypadkach, lecz jak dotąd nie została ona przeprowadzona.

Kamień milowy 1.1: Aby w pełni scharakteryzować niszę komórek IgE B w CRSwNP i alergicznym nieżycie nosa, badacze pobiorą wiele próbek od 25 pacjentów z CRSwNP, 25 CRSsNP i 25 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa i alergią na HDM. Ponadto zostaną pobrane biopsje migdałków jako wskaźnik ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej. Od 5 pacjentów z alergią na HDM, z wysokim poziomem IgE, wyizolowano tkankę nosa (małżowinę dolną) i migdałki, po czym wyizolowano te tkanki i poddano je dokładnej charakteryzacji niszy komórek IgE B.

Kamień milowy 1.2: W tym kamieniu milowym badacze postarają się uzyskać bardzo szczegółową mapę odpowiedzi komórek IgE B oraz sposobu ich regulacji w niszy typu 2 w CRSwNP i alergicznym nieżycie nosa. W tym celu wygenerujemy wysokiej rozdzielczości mapę jednokomórkową polipa nosa, tkanki małżowiny dolnej i migdałków do 10-krotnego protokołu genomowego 5'VDJ seq. Tworząc mapę o wysokiej rozdzielczości podzbiorów komórek B i profili ich receptorów immunologicznych, badacze chcą zrozumieć, w jaki sposób regulowane i napędzane są przewlekłe odpowiedzi komórek B typu IgE typu 2 w chorobach niealergicznych i alergicznych typu 2. Do tej analizy zostanie wykorzystany pakiet oprogramowania bioinformatycznego DALI (Digital Adressable Lighting Interface). Badacze będą tutaj szczególnie starali się prześledzić pochodzenie plazmablastów IgE+ lub klonów komórek plazmatycznych poprzez odpowiedzi ośrodków rozmnażania lub bezpośrednio z naiwnych komórek B w odpowiedziach pozapęcherzykowych. Ponadto analiza NicheNet umożliwi wykrycie regulatorów odpowiedzi komórek IgE B, takich jak inne komórki odpornościowe lub komórki strukturalne. To narzędzie programowe analizuje potencjalne pary nadawca-odbiorca pod kątem cytokin, chemokin i ligandów komórkowych w oparciu o zróżnicowaną ekspresję genów i wyselekcjonowane listy receptor-ligand.

Pakiet roboczy 2: Chociaż w wydzielinach nosowych i tkankach pacjentów z CRSwNP można wykryć wysoki poziom polireaktywnej IgE, nie jest jasne, czy rekombinacja zmiany klasy do IgE jest napędzana przez antygen, czy przez czynniki związane z uszkodzeniem.

Kamień milowy 2.1: Do chwili obecnej charakterystyka IgE w NP pozostaje zagadkowa, jednak te IgE są kluczem do zrozumienia ich roli w biologii choroby. Aby wyjaśnić charakterystykę NP IgE, badacze wygenerują 20 monoklonalnych przeciwciał IgE od każdego z 5 pacjentów z CRSwNP i podobnie wygenerowanych zostanie 20 monoklonalnych przeciwciał IgE od każdego z 5 pacjentów z alergicznym nieżytem nosa. W ten sposób zostaną odzyskane pełnej długości sekwencje łańcucha ciężkiego i lekkiego klonów IgE+ i wytworzone jako rekombinowane przeciwciała monoklonalne. Ponadto oceniane będzie, że przeciwciała NP IgE wykazują polireaktywność, dzięki czemu są w stanie wiązać się z kilkoma antygenami, co jest cechą przypisywaną tzw. naturalnej IgE.

Kamień milowy 2.2: Przeprowadzając bezstronną analizę proteomu jamy nosowej, badacze chcą uzyskać nowy wgląd w lokalne czynniki regulujące odpowiedź komórek IgE B. Przyjmując to całościowe spojrzenie w połączeniu z najnowocześniejszymi metodami analizy pojedynczych komórek, zespół po raz pierwszy będzie w stanie odkryć, w jaki sposób wzajemne oddziaływanie z rozregulowanym mikrobiomem lub rozległym uszkodzeniem tkanek odgrywa rolę w wywoływaniu odpowiedzi komórek IgE B . Analiza proteomu jamy nosowej metodą bezstronnej spektrometrii masowej MS/MS typu shotgun na próbkach wydzieliny z nosa od tych samych pacjentów. Ta analiza proteomu jamy nosowej pozwoli nam uzyskać bezstronny obraz czynników, które mogą napędzać lokalne odpowiedzi IgE.

Kamień milowy 2.3: Aby mechanistycznie zrozumieć, w jaki sposób rekombinacja zmiany klasy IgE jest indukowana w polipach nosa, należy założyć wspólną hodowlę komórek nabłonkowych – PBMC (komórek jednojądrzastych krwi obwodowej) i wywołać rekombinację zmiany klasy IgE w tych hodowlach. Pierwsze komórki nabłonkowe od pacjentów z CRSwNP lub alergicznym zapaleniem błony śluzowej nosa zostaną namnożone i umieszczone w kokulturze na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) z PBMC od odpowiednich dawców. Po pierwsze, zespół rozpocznie od naśladowania wpływu uszkodzenia nabłonka na rekombinację zmiany klasy IgE poprzez dodanie IL-33 (typowej alarminy) do wspólnych kultur komórek PBMC i nabłonka. Następnie hodowle te będą inkubowane ze Staphylococcus aureus (szczepem bakterii często kolonizującym jamę nosową pacjentów z CRSwNP) lub Candida albicans (grzybem często kolonizującym jamę nosową pacjentów z CRSwNP). Na koniec badacze przetestują różne kombinacje tych ostatnich czynników. W tych hodowlach indukcja odpowiedzi komórek B ośrodka rozrodczego (IgG1+ i IgE+ CD20+BCL6+), blastów osocza (IgG1+ i IgE+CD20+CD138+) oraz komórek plazmatycznych (IgG1 i IgE+CD20-CD138+) metodą wielobarwnej cytometrii przepływowej będzie oceniony. Eksperymenty te wyjaśnią, w jaki sposób instrukcje wydawane przez nabłonek pacjentów z polipem nosa lub alergicznym nieżytem nosa w odpowiedzi na odpowiednie czynniki wyzwalające wpływają na przełączanie klas IgE w limfocytach B. T

Strona robocza 3: Ocena wpływu dupilumabu na modulację lokalnych odpowiedzi komórek IgE B. Uzasadnienie: Ponieważ Dupilumab jest ukierunkowany na kluczowe regulatory przełączania klas IgE, badacze sprawdzą, czy istnieją jakiekolwiek różnice w mechanizmach selekcji IgE podczas leczenia dupilumabem.

Kamień milowy 3.1: Ocena lokalnej modulacji odpowiedzi komórek B IgE w CRSwNP przez dupilumab W celu sprawdzenia, czy dupilumab wpływa na regulację lokalnego IgE, zostaną zebrane próbki od 5 pacjentów z CRSwNP leczonych dupilumabem. W tym miejscu przeanalizowane zostaną całkowite poziomy IgE w wydzielinie z nosa, aby sprawdzić, czy u tych pacjentów leczenie dupilumabem miało wpływ na lokalną produkcję IgE. W celu wyjaśnienia molekularnych mechanizmów immunologicznych, tkanka polipów nosa pacjentów leczonych dupilumabem zostanie poddana analizie pod kątem jednokomórkowej sekw. VDJ i porównana z danymi uzyskanymi na stronie pracy 2 oraz sprawdzi, czy występują jakiekolwiek zmiany w klonalnych odpowiedziach IgE na IL-4 Blokowanie /IL-13. W podobnym teście, jak opisano w pakiecie roboczym 2, założymy wspólne hodowle komórek nabłonkowych i PBMC, jak wyjaśniono w pakiecie roboczym 2 i zablokujemy sygnalizację IL-4/-13 poprzez dodanie dupilumabu do pożywki hodowlanej. Ocenimy tutaj wpływ na odpowiedź komórek IgE B za pomocą cytometrii przepływowej.