Wpływ PEA na regenerację mięśni po ćwiczeniach oporowych

Projekt badania Protokół obejmuje podwójnie ślepą, kontrolowaną placebo próbę krzyżową, do której włączani są nieelitarni sportowcy płci męskiej (obciążenie treningowe > 5 godz./tydz., n=14). Uczestnicy przechodzą 2 sesje eksperymentalne, podczas których otrzymują PEA lub placebo w losowej kolejności. Dwie sesje są oddzielone 3-tygodniowym okresem wymywania, aby umożliwić pełne wyzdrowienie po ekscentrycznej serii ćwiczeń. Naukowe uzasadnienie zastosowania projektu wewnątrzobiektowego opiera się na założeniu zmniejszonej zmienności danych i zwiększonej mocy statystycznej w porównaniu z projektem międzyobiektowym. Dodatkowo stosuje się podwójnie ślepą próbę kontrolowaną placebo, aby zapobiec stronniczości leczenia i efektom placebo.

Uczestnicy są losowo przydzielani do otrzymywania PEA lub dopasowanych pod względem wyglądu suplementów placebo dwa razy dziennie przez łącznie 6 dni. Trzy dni przed rozpoczęciem suplementacji (D-3) zbierane są pomiary wyjściowe, podczas których uczestnicy zgłaszają się do laboratorium na czczo i wypoczęty i zaznaczają odczuwaną bolesność mięśni na wizualnej skali analogowej (VAS). Następnie pobierane są próbki krwi i biopsje mięśni, po czym oceniane są maksymalne skurcze dobrowolne izometryczne, ekscentryczne i koncentryczne oraz wysokość wyskoku (skok w przeciwną stronę i skok z przysiadu). Ponadto uczestnicy wypełniają Pittsburgh Sleep Quality Index (PSQI), aby ocenić jakość i ilość snu z poprzedniego miesiąca. Trzy dni po zebraniu pomiarów wyjściowych (D0) uczestnicy wracają do laboratorium w stanie wypoczętym i na czczo. Po pobraniu krwi na czczo otrzymują pierwszą suplementację w postaci lekkiego standaryzowanego śniadania (~500 kcal, 60% węglowodanów, 20% białka, 20% tłuszczu). Następnie oceniają odczuwaną przez siebie bolesność mięśni i wypełniają kwestionariusz St. Mary's Hospital (w celu oceny jakości i ilości snu z poprzedniej nocy). Godzinę po przyjęciu suplementu uczestnicy wykonują jednostronne ćwiczenie ekscentryczne (EE) składające się z 24 zestawów po 10 ekscentrycznych skurczów prostowników kolana. Pomiary maksymalnych skurczów dowolnych i wysokości skoku są powtarzane 24, 48, 72 i 120 godzin po EE. Dodatkowo próbki krwi pobiera się 24, 48, 72, 96 i 120 godzin po EE, a biopsje mięśni pobiera się 48 godzin po EE. Ponadto uczestnicy oceniają odczuwaną przez siebie bolesność mięśni, wypełniają dzienniczek jedzenia i wypełniają kwestionariusz St. Mary's Hospital (codziennie) przez cały czas trwania protokołu eksperymentalnego.

Badanie przesiewowe Wolontariusze są poddawani badaniu przesiewowemu w celu oceny, czy kwalifikują się do udziału w badaniu na podstawie kryteriów włączenia i wykluczenia . Podczas badania mierzona jest masa ciała za pomocą wagi cyfrowej z dokładnością do 0,1 kg oraz wysokość ciała z dokładnością do 1 cm. Ponadto uzyskuje się kwestionariusz medyczny w celu oceny ogólnego stanu zdrowia uczestników. Gdy ochotnicy zostaną uznani za kwalifikujących się zgodnie z wynikami badań przesiewowych oraz kryteriami włączenia i wykluczenia, zostaną włączeni do badania.

Zapoznanie się Aby zapobiec jakimkolwiek efektom uczenia się podczas próby interwencyjnej, wszyscy uczestnicy zapoznają się ze sprzętem testowym co najmniej na tydzień przed rozpoczęciem próby. Uczestnicy są proszeni o wykonanie 3 submaksymalnych izometrycznych, ekscentrycznych i koncentrycznych dobrowolnych skurczów oraz 3 skoków w przeciwną stronę i skoków z przysiadu, jak opisano szczegółowo poniżej (patrz paragraf 76.3 na stronie 12). Uczestnicy są instruowani o prawidłowej technice wykonywania ruchów i cały czas są pod opieką pracownika obsługi. Podczas zapoznawania ustalane są indywidualne ustawienia na hamowni izokinetycznej, które będą wykorzystywane we wszystkich kolejnych pomiarach. Dodatkowo uczestnicy są instruowani, jak wypełniać dzienniczki żywieniowe.

Randomizacja: uczestnicy są losowo przydzielani do jednej z dodatkowych grup (PEA lub placebo) podczas pierwszej sesji. Po 3-tygodniowym okresie wypłukiwania uczestnicy są przenoszeni do drugiej grupy suplementów. Randomizacja jest przeprowadzana przez badacza w naszym laboratorium, który nie jest zaangażowany w żadną z procedur eksperymentalnych. W związku z tym zarówno uczestnicy, jak i badacze przeprowadzający pomiary nie są świadomi kolejności, w jakiej uczestnicy otrzymują różne suplementy. Sekwencja randomizacji zostanie wygenerowana przez członka grupy badawczej, który nie jest zaangażowany w bieżące badanie, za pomocą narzędzia online (RANDOM.ORG - Integer Set Generator). Kody ukrywania tożsamości są używane na liście randomizacji, która jest bezpiecznie przechowywana przez tego samego członka grupy badawczej, który nie jest zaangażowany w bieżące badanie.

Zaślepianie: Aby uniknąć stronniczości, ramiona leczenia będą zaślepione dla Badaczy/personelu/uczestników badania w następujący sposób: suplement zostanie wyprodukowany, zapakowany i oznakowany w taki sposób, aby wygląd, zapach i/lub dotyk suplementu można odróżnić od placebo. Suplementy dostarczane są uczestnikom przez członka grupy badawczej, który nie bierze udziału w żadnej z procedur eksperymentalnych ani analiz. Ponadto, aby utrzymać ślepotę, suplement i placebo będą podlegać tej samej drodze i procesowi podawania.

Odślepienie: Po ukończeniu badania przez wszystkich uczestników i zakończeniu wszystkich analiz w laboratorium mokrym baza danych zostanie zablokowana, a zebrane dane z badania zostaną odślepione, aby umożliwić analizę statystyczną danych z badania. Po zakończeniu analizy danych, PI przekaże wyznaczonym badaczom niezaślepione informacje o leczeniu dla wszystkich uczestników.

W nagłych przypadkach w zaślepionym badaniu, badacz ponosi wyłączną odpowiedzialność za ustalenie, czy uzasadnione jest przedwczesne ujawnienie przydziału leczenia uczestnika. Przy podejmowaniu takich decyzji zawsze należy brać pod uwagę bezpieczeństwo uczestników. W stosownych przypadkach należy odnotować datę i przyczynę odślepienia.

Protokół ćwiczenia ekscentrycznego niszczącego mięśnie (EE) Uczestnicy wykonują 5-minutową rozgrzewkę na ergometrze rowerowym o mocy 100 W. Następnie odbywają się na dynamometrze izokinetycznym, gdzie ich górna część ciała jest przywiązana do krzesła, aby ustabilizować tułów, a ich prawa noga jest przywiązana do ramienia dźwigni. Protokół EE składa się z 24 zestawów 10 izokinetycznych jednostronnych skurczów ekscentrycznych prostowników stawu kolanowego z prędkością kątową -30⁰/s i zakresem ruchu od 180⁰ do 60⁰ (gdzie 180⁰ odnosi się do pełnego wyprostu). Pomiędzy seriami przewidziano 60 sekund odpoczynku. Uczestników zachęca się ustnie, aby maksymalnie opierali się rotacji ramienia dźwigni w dół podczas ekscentrycznej fazy ruchu. Podczas koncentrycznej fazy ruchu nie jest stawiany żaden opór. Wykazano, że ten ekscentryczny protokół ćwiczeń skutecznie wywołuje uszkodzenie mięśni, jak wykazano w poprzednich badaniach.

Suplementy Uczestnicy otrzymują suplementy PEA i placebo przy dwóch różnych okazjach w przypadkowej kolejności. Suplementy PEA zawierają 350 mg Levagen+ (315 mg PEA i 35 mg substancji pomocniczych), a suplementy placebo zawierają 350 mg maltodekstryny. Levagen+ składa się w 90% z palmitoiloetanoloamidu i w 10% z mieszanki oleju kokosowego (frakcjonowanego), polirycynooleinianu poliglicerolu, olejku cytrusowego, oliwy z oliwek, lecytyny, octanu dl-alfa tokoferylu i dwutlenku krzemu w celu poprawy biodostępności PEA. Zarówno suplementy PEA, jak i placebo są pakowane w nieprzezroczyste twarde kapsułki, aby zapewnić, że nie ma różnic w wyglądzie ani smaku. Uczestników instruuje się, aby przyjmowali suplement dwa razy dziennie (rano i na godzinę przed snem) przez 6 kolejnych dni, począwszy od zebrania podstawowych pomiarów.

Aktywność fizyczna i kontrola diety Uczestnicy proszeni są o utrzymanie nawykowych wzorców aktywności (np. rowerem do klasy). Jednak poinstruowano ich, aby nie wykonywali żadnych umiarkowanych lub forsownych ćwiczeń podczas i 72 godziny przed rozpoczęciem sesji eksperymentalnej. Co więcej, na 24 godziny przed pobraniem biopsji mięśnia nie wolno wykonywać żadnych ćwiczeń.

Uczestnicy otrzymują wystandaryzowany posiłek (1200 kcal; 180 g CHO, 33 g tłuszczu, 45 g białka) wieczorem przed EE oraz wieczorem przed pobraniem biopsji mięśnia. W dni badań, kiedy uczestnicy muszą zgłosić się do laboratorium na czczo, po zakończeniu wszystkich pomiarów zapewnione jest śniadanie (500 kcal). To samo śniadanie serwowane jest na 1 godzinę przed rozpoczęciem EE. Ponadto uczestnicy codziennie wypełniają dziennik żywności, zaczynając od pomiarów wyjściowych, w celu sprawdzenia możliwych różnic dietetycznych między warunkami. Analizy dietetyczne przeprowadzane są za pomocą platformy internetowej do rejestracji i analizy składu makroskładników i mikroelementów (https://mijn.voedingscentrum.nl/nl/eetmeter/). Podczas sesji eksperymentalnych uczestnikom nie wolno spożywać napojów alkoholowych ani zawierających kofeinę.

Próbki krwi Krew (2x10 mL) jest pobierana z żyły ramienia (system Venoject), a osocze lub surowica są natychmiast oddzielane przez wirowanie. Próbki osocza i surowicy rozdziela się na różne porcje po 1 ml i przechowuje w temperaturze -20°C do późniejszego wykorzystania do testów biochemicznych. Próbki krwi pobiera się na linii podstawowej, bezpośrednio przed EE i 24, 48, 72, 96 i 120 godzin po EE na czczo.

Próbki osocza są analizowane za pomocą odpowiedniego testu immunoenzymatycznego (ELISA) na CK (marker uszkodzenia mięśni), IL-6 i TNFalpha (oba markery ogólnoustrojowego zapalenia). Stężenia PEA ocenia się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas. Można przeprowadzić dodatkowe testy na próbkach krwi, jeśli uzna się to za stosowne po przeprowadzeniu analiz pierwotnych. Po przeprowadzeniu wszystkich analiz pozostała próbka jest przechowywana przez dodatkowe 3 lata, zanim zostanie trwale zniszczona.

Biopsje mięśni Biopsje mięśni pobiera się na linii podstawowej i 48 godzin po EE z kończyny dominującej na czczo. W związku z tym podczas całego badania pobiera się łącznie 4 biopsje na pacjenta. Biopsje są pobierane przez doświadczonego lekarza (dr. Ruud Van Thienen) z m. vastus lateralis trenowanej nogi za pomocą igły Bergström o średnicy 5 mm, jak opisano wcześniej (29). Krótko mówiąc, wykonuje się małe nacięcie (~5 mm) przez skórę i leżącą pod nią powięź w znieczuleniu miejscowym (lidokaina, 1 ml), aby ułatwić płynne wbicie igły w brzuch mięśnia. Po umieszczeniu igły w brzuchu mięśnia, do górnego końca igły zostaje przymocowana rurka i strzykawka, która służy do wytworzenia próżni, dzięki której mięsień jest wciągany do igły. W tym momencie płynny ruch obrotowy w dół wewnętrznej części igły przecina tkankę w celu pobrania próbki mięśnia. Po pocięciu tkanki (~150-300 mg mięśnia) próbki są uwalniane od widocznej krwi i tkanki łącznej przed zamrożeniem w ciekłym azocie. Nacięcie, które zostało wykonane przez skórę, zostanie zamknięte za pomocą pasków samoprzylepnych (steristtrips) i zabandażowane wodoodpornym plastrem. Uczestnicy będą nosić plaster przez 5 dni, zanim będą mogli go zdjąć. W ciągu tych 5 dni uczestnicy mogą wziąć prysznic, ale zostaną poinstruowani, aby nie zanurzać ani nie zanurzać plastra (tj. kąpać się lub pływać). Uczestnicy zostaną ostrzeżeni o tym, że po zabiegu biopsji mięśnia pozostaje niewielka blizna wielkości około 5 mm, która najprawdopodobniej będzie niewidoczna po roku lub dwóch latach. Ponadto znieczulenie miejscowe zapewnia, że ​​podczas zabiegu nie odczuwa się bólu, ale czujniki mechaniczne w mięśniach pozostają czułe. W związku z tym uczestnicy mogą odczuwać ucisk, ale nie ból. Po zabiegu mięsień może być sztywny przez dzień lub dwa.

Biopsje mięśni są analizowane biochemicznie w naszym laboratorium (laboratorium Fizjologii Wysiłkowej, KU Leuven) pod kątem parametrów stanu zapalnego mięśni, stresu, regeneracji i anabolizmu.

Maksymalny dobrowolny skurcz (MVC) prostowników stawu kolanowego Izometryczny, ekscentryczny i koncentryczny moment obrotowy prostownika stawu kolanowego trenowanej nogi mierzy się za pomocą dynamometru izokinetycznego (por. (28)) na początku badania i 24, 48, 72 i 120 godzin po EE. Krótko mówiąc, uczestnicy siedzą z górną częścią ciała przywiązaną do krzesła w celu ustabilizowania tułowia i wytrenowaną nogą przywiązaną do ramienia dźwigni. Dla maksymalnego izometrycznego szczytu dobrowolnego skurczu staw kolanowy jest ustawiony pod kątem 90⁰. Uczestnicy są instruowani, aby maksymalnie napiąć prostowniki kolana i utrzymać je przez 3 sekundy. Maksymalne ekscentryczne i koncentryczne dobrowolne skurcze są mierzone przy prędkości kątowej 30⁰/s i zakresie ruchu między 180-60⁰ (gdzie 180⁰ odnosi się do pełnego wyprostu). Każdy ruch wykonywany jest trzy razy z 60-sekundową przerwą między próbami. Do analizy wykorzystuje się maksymalną szczytową wartość momentu obrotowego uzyskaną pomiędzy próbami.

Skok w przeciwną stronę Uczestnicy wykonują skok w przeciwną stronę (CMJ) na platformie siłowej (SMARTJUMP, Fusion sport, Nottingham, Wielka Brytania) na linii podstawowej oraz 24, 48, 72 i 120 godzin po EE. Uczestnicy proszeni są o przyjęcie pozycji wyprostowanej (kąt kolan 180⁰) ze stopami na szerokości bioder, zanim zaczną ruch w dół do pozycji przysiadu (kąt kolan 90⁰), po czym skaczą pionowo na maksymalną wysokość. Uczestnicy są poinstruowani, aby położyć ręce na biodrach i utrzymywać ciało w pozycji wyprostowanej przez cały skok. CMJ wykonuje się trzy razy z 60-sekundową przerwą między próbami. Do analizy wykorzystywany jest najwyższy zarejestrowany skok.

Skok z przysiadu Uczestnicy wykonują skok z przysiadu (SJ) na platformie siłowej na linii podstawowej oraz 24, 48, 72 i 120 godzin po EE. Uczestnicy proszeni są o rozpoczęcie w pozycji przysiadu (kąt kolana 90⁰) i utrzymanie tej pozycji przez 3 sekundy, zanim skoczą pionowo na maksymalną wysokość. Uczestnicy są poinstruowani, aby położyć ręce na biodrach i utrzymywać ciało w pozycji wyprostowanej przez cały skok. SJ wykonuje się trzy razy z 60-sekundową przerwą między próbami. Do analizy wykorzystywany jest najwyższy zarejestrowany skok.

Bolesność mięśni Bolesność mięśni trenowanej nogi jest oceniana na początku badania, bezpośrednio przed EE oraz 24, 48, 72, 96 i 120 godzin po EE przy użyciu wizualnej skali analogowej (VAS). Uczestnicy proszeni są o utrzymanie pozycji przysiadu przez 3 sekundy z rękami na biodrach i zaznaczenie postrzeganej bolesności mięśni na skali, która jest reprezentowana przez linię o długości 100 mm, z której skrajna lewa reprezentuje „brak bólu”, a skrajna prawa reprezentuje „ekstremalny ból”.

Jakość i ilość snu Wyjściowo zwyczajowa higiena snu uczestników jest oceniana za pomocą Indeksu Jakości Snu Pittsburgha. Ponadto uczestnicy codziennie wypełniają kwestionariusz St. Mary's Hospital, aby ocenić jakość i ilość snu z poprzedniej nocy, począwszy od nocy poprzedzającej pomiary wyjściowe. Kwestionariusz St. Mary's Hospital okazał się niezawodnym narzędziem do oceny snu osoby badanej z poprzedniej nocy.