Charakterystyka proteomu surowicy u młodych otyłych osób (POSING) (POSING)

Projekt eksperymentu Badanie obejmuje fazę odkrywania, w której zostanie przeprowadzona analiza proteomiczna surowicy pacjentów włączonych do badania. Ta faza umożliwi zidentyfikowanie niewielkiej liczby możliwych kandydujących markerów, które zostaną zweryfikowane w kolejnej fazie z większą liczbą pacjentów.

Pacjenci:

W fazie odkrywania zostanie wziętych pod uwagę 60 osobników w okresie dojrzewania (30 mężczyzn i 30 kobiet). Przedmioty zostaną podzielone na dwie grupy:

• grupa kontrolna obejmująca osoby bez stłuszczenia, weryfikowane metodą ultrasonograficzną według wystandaryzowanych kryteriów [10,11], z wynikiem APRI < 0,3;
• grupa badana z osobami, u których obecność stłuszczenia została potwierdzona technikami ultrasonograficznymi oraz z wynikiem APRI > 0,50.

Dla każdego pacjenta następujące zmienne będą brane pod uwagę w warunkach początkowych, tj. w momencie pobierania próbki.

• parametry antropometryczne (wzrost, waga, BMI, obwód talii);
• skład ciała (masa beztłuszczowa, masa tkanki tłuszczowej) metodą pomiaru impedancji (BIA);
• poziomy stłuszczenia mierzone ultrasonograficznie według standardowych kryteriów
• parametry biochemiczne krwi
• podstawowa przemiana materii z wykorzystaniem kalorymetrii pośredniej;
• parametry biochemiczne warunkujące zespół metaboliczny (cholesterol HDL, trójglicerydy, cukier we krwi);
• parametry biochemiczne do przewidywania stłuszczenia wątroby za pomocą markerów zastępczych (AST, ALT, GGT, płytki krwi, fosfataza alkaliczna, albumina);
• ciśnienie krwi;
• jednocześnie stosowane terapie hormonalne (hormon wzrostu, sterydy płciowe i/lub l-tyroksyna).

Pobieranie surowicy Próbki krwi na czczo zostaną pobrane przez standardowe nakłucie żyły do ​​probówek do separacji surowicy BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) i odwirowane przy 1900 g w 4°C przez 10 min i przy 16 000 g w 4°C przez kolejne 10 min. Supernatanty zostaną przeniesione do nowych probówek, a następnie zamrożone w temperaturze -80°C w celu długoterminowego przechowywania.

Analiza proteomiczna Przed analizą proteomiczną obecność hemoglobiny zostanie oceniona za pomocą spektrofotometru Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) przy użyciu bezpośredniej metody spektrofotometrycznej Harboe z poprawką Allena: Hb ( g / L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / rozcieńczenie w dH2O. Punkt odcięcia brany pod uwagę dla surowicy będzie wynosił 0,020 g/l.

Do charakterystyki proteomicznej surowicy zostanie wykorzystana nowa wysokowydajna technologia omiczna oparta na platformie SomaLogic SOMAscan. System opiera się na detekcji SOMAmerów (Slow Off-rate Modified Aptamer), które są aptamerycznymi formami DNA o wysokim powinowactwie i specyficzności względem docelowego białka. Ponadto aptamery te są oporne na aktywność nukleotydazy i wykazują wyższe powinowactwo niż normalne przeciwciała. Panel użyty w tym badaniu pozwoli nam ocenić 1500 celów białkowych, które biorą udział w rozwoju chorób metabolicznych, są częścią ogólnej odpowiedzi zapalnej i są interesujące w badaniu chorób sercowo-naczyniowych, a także w onkologii.

Ogólnie czułość i wydajność testu są porównywalne z normalnym zestawem ELISA, z limitami oznaczania ilościowego około 100 fM i wykrywalności 40 fM, przy czym potrzeba tylko 65 µl próbki.

Walidacja Walidacja 2 markerów wybranych na podstawie istotności i różnic w ekspresji między grupami zostanie potwierdzona metodą ELISA. W tej fazie każdy marker zostanie poddany walidacji poprzez oznaczenie jego stężenia w surowicy 60 osób (włączonych do fazy odkrywania) i innych 32 uzupełniających się osób, aby osiągnąć wielkość próby potrzebną do uzyskania odpowiedniej istotności statystycznej.

Ponadto eksperymenty zostaną skonfigurowane tak, aby obejmowały kontrole pozytywne i negatywne oraz kontrole w celu sprawdzenia zmienności między płytkami, zgodnie z procedurami konfiguracji testu ELISA. Krzywe wzorcowe zostaną obliczone w celu określenia bezwzględnej ilościowej oceny interesujących markerów w surowicy.