Charakterizace sérového proteomu u mladých obézních subjektů (POSING) (POSING)

Experimentální design Studie zahrnuje fázi objevování, ve které bude provedena sérová proteomická analýza subjektů zahrnutých do studie. Tato fáze umožní identifikovat malý počet možných kandidátských markerů, které budou validovány v následné fázi s větším počtem subjektů.

Pacienti:

Ve fázi objevování bude vzato v úvahu 60 pubescentních subjektů (30 mužů a 30 žen). Předměty budou rozděleny do dvou skupin:

• kontrolní skupina zahrnující subjekty s absencí steatózy, ověřenou ultrazvukovou metodou podle standardizovaných kritérií [10,11] a s APRI skóre < 0,3;
• studijní skupina se subjekty s prokázanou přítomností steatózy pomocí ultrazvukových technik a se skóre APRI > 0,50.

U každého pacienta budou uvažovány následující proměnné ve výchozích podmínkách, tj. v době odběru vzorku.

• antropometrické parametry (výška, váha, BMI, obvod pasu);
• složení těla (libová hmota, tuková hmota) pomocí techniky měření impedance (BIA);
• úrovně steatózy měřené ultrazvukem podle standardních kritérií
• parametry krevní chemie
• základní metabolismus pomocí nepřímé kalorimetrie;
• biochemické parametry určující metabolický syndrom (HDL cholesterol, triglyceridy, krevní cukr);
• biochemické parametry pro predikci steatózy jater pomocí náhradních markerů (AST, ALT, GGT, krevní destičky, alkalická fosfatáza, albumin);
• krevní tlak;
• souběžné hormonální terapie (terapie růstovým hormonem, pohlavní steroidy a/nebo l-tyroxin).

Odběr séra Vzorky krve nalačno budou odebírány standardní venepunkcí do zkumavek BD Vacutainer® pro separaci séra (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) a centrifugovány při 1900 g při 4 °C po dobu 10 minut a při 16 000 g při 4 °C po dobu dalších 10 minut. min. Supernatanty budou přeneseny do nových zkumavek a následně zmrazeny na -80 °C pro dlouhodobé skladování.

Proteomická analýza Před proteomickou analýzou bude vyhodnocena přítomnost hemoglobinu spektrofotometrem Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) za použití přímé spektrofotometrické metody Harboe s Allenovou korekcí: Hb ( g / L) = (167, 2 x A415 - 83,6 x A380 - 83,6 x A450) x 1/1000 x 1 / ředění v dH20. Uvažovaná hranice pro sérum bude 0,020 g/l.

Pro proteomickou charakterizaci séra bude použita nová vysoce výkonná omická technologie založená na platformě SomaLogic SOMAscan. Systém je založen na detekci SOMAmerů (Slow Off-rate Modified Aptamer), což jsou aptamerní formy DNA s vysokou afinitou a specificitou pro proteinový cíl. Kromě toho jsou tyto aptamery odolné vůči nukleotidázové aktivitě a vykazují vyšší afinitu než normální protilátky. Panel použitý v této studii nám umožní vyhodnotit 1500 proteinových cílů, které se podílejí na rozvoji metabolických onemocnění, jsou součástí obecné zánětlivé reakce a jsou zajímavé ve studiu kardiovaskulárních onemocnění a také v onkologii.

Obecně je citlivost a výkonnost testu srovnatelná s normální soupravou ELISA, s limity pro kvantifikaci kolem 100 fM a detekci 40 fM a potřebou pouze 65 µl vzorku.

Validace Validace 2 markerů vybraných na základě významnosti a rozdílné exprese mezi skupinami bude validována metodou ELISA. V této fázi bude každý marker validován stanovením jeho koncentrace v séru 60 subjektů (zahrnutých ve fázi objevování) a dalších 32 komplementárních subjektů, aby se dosáhlo velikosti vzorku užitečné pro získání vhodné statistické významnosti.

Kromě toho budou experimenty nastaveny tak, aby zahrnovaly pozitivní a negativní kontroly a kontroly pro kontrolu variability mezi plotnami, jak to vyžadují postupy nastavení testu ELISA. Pro stanovení absolutní kvantifikace sledovaných markerů v séru budou vypočteny standardní křivky.