Характеристика протеома сыворотки у молодых людей с ожирением (POSING) (POSING)

План эксперимента Исследование включает фазу открытия, на которой будет проводиться протеомный анализ сыворотки субъектов, включенных в исследование. Этот этап позволит определить небольшое количество возможных маркеров-кандидатов, которые будут проверены на последующем этапе с большим количеством субъектов.

Пациенты:

На этапе обнаружения будут приняты во внимание 60 половозрелых субъектов (30 мужчин и 30 женщин). Темы будут разделены на две группы:

• контрольная группа включала лиц с отсутствием стеатоза, верифицированным ультразвуковым методом по стандартизированным критериям [10,11], и с оценкой APRI <0,3;
• исследовательская группа с субъектами с доказанным наличием стеатоза с помощью ультразвуковых методов и с оценкой APRI> 0,50.

Для каждого пациента следующие переменные будут учитываться в исходных условиях, т. е. во время сбора образцов.

• антропометрические параметры (рост, вес, ИМТ, окружность талии);
• состав тела (безжировая масса, жировая масса) с использованием метода измерения импеданса (BIA);
• уровни стеатоза, измеренные с помощью ультразвука в соответствии со стандартными критериями
• показатели биохимии крови
• основной метаболизм с помощью непрямой калориметрии;
• биохимические показатели, определяющие метаболический синдром (холестерин ЛПВП, триглицериды, сахар крови);
• биохимические параметры для прогнозирования стеатоза печени с использованием суррогатных маркеров (АСТ, АЛТ, ГГТ, тромбоциты, щелочная фосфатаза, альбумин);
• артериальное давление;
• сопутствующая гормональная терапия (терапия гормоном роста, половые стероиды и/или L-тироксин).

Сбор сыворотки Образцы крови натощак будут собираться путем стандартной венепункции в пробирки для разделения сыворотки BD Vacutainer® (BD - Plymouth PL6 7BP, Великобритания) и центрифугироваться при 1900g при 4°C в течение 10 минут и при 16000g при 4°C еще 10 минут. мин. Супернатанты будут перенесены в новые пробирки и впоследствии заморожены при температуре -80°C для длительного хранения.

Протеомный анализ Перед протеомным анализом будет проведена оценка наличия гемоглобина на спектрофотометре Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Бреа, Калифорния, США) с использованием прямого спектрофотометрического метода Харбо с поправкой Аллена: Hb (г/л) = (167, 2 × А415 — 83,6 × А380 — 83,6 × А450) х 1/1000 х 1/разведение в dH2O. Пороговое значение, рассматриваемое для сыворотки, будет составлять 0,020 г/л.

Для протеомной характеристики сыворотки будет использоваться новая высокопроизводительная омиксная технология, основанная на платформе SomaLogic SOMAscan. Система основана на обнаружении SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), которые представляют собой аптамерные формы ДНК с высокой аффинностью и специфичностью в отношении белка-мишени. Кроме того, эти аптамеры устойчивы к нуклеотидазной активности и демонстрируют более высокую аффинность, чем нормальные антитела. Панель, используемая в этом исследовании, позволит нам оценить 1500 белков-мишеней, которые участвуют в развитии метаболических заболеваний, являются частью общей воспалительной реакции и представляют интерес для изучения сердечно-сосудистых заболеваний, а также в онкологии.

В целом, чувствительность и производительность теста сравнимы с чувствительностью и эффективностью обычного набора ELISA, с ограничениями для количественного определения около 100 фМ и обнаружения 40 фМ, а также требуется всего 65 мкл образца.

Валидация Валидация 2 маркеров, выбранных на основе значимости и дифференциальной экспрессии между группами, будет подтверждена методом ELISA. На этом этапе каждый маркер будет подтвержден путем определения его концентрации в сыворотке 60 субъектов (включенных в фазу обнаружения) и других 32 дополнительных субъектов для достижения размера выборки, пригодного для получения соответствующей статистической значимости.

Кроме того, эксперименты будут организованы таким образом, чтобы включать положительные и отрицательные контроли и контроли для проверки вариабельности между планшетами, как того требуют процедуры настройки анализа ELISA. Стандартные кривые будут рассчитаны для определения абсолютного количества представляющих интерес маркеров в сыворотке.