Karakterisering af serumproteom hos unge overvægtige forsøgspersoner (POSING) (POSING)

Eksperimentelt design Studiet omfatter en opdagelsesfase, hvor en serum proteomisk analyse af de forsøgspersoner, der indgår i undersøgelsen, vil blive udført. Denne fase vil gøre det muligt at identificere et lille antal mulige kandidatmarkører, som vil blive valideret i en efterfølgende fase med et større antal emner.

Patienter:

I opdagelsesfasen vil 60 pubertære forsøgspersoner (30 mænd og 30 kvinder) blive taget i betragtning. Fagene vil blive opdelt i to grupper:

• kontrolgruppe inklusive forsøgspersoner med fravær af steatose, verificeret ved ultralydsmetode i henhold til standardiserede kriterier [10,11] og med APRI-score < 0,3;
• studiegruppe med forsøgspersoner med påvist tilstedeværelse af steatose ved hjælp af ultralydsteknikker og med APRI-score > 0,50.

For hver patient vil følgende variabler blive overvejet i basislinjetilstande, dvs. på tidspunktet for prøvetagning.

• antropometriske parametre (højde, vægt, BMI, taljeomkreds);
• kropssammensætning (mager masse, fedtmasse), ved hjælp af impedansmålingsteknikken (BIA);
• niveauer af steatose målt med ultralyd i henhold til standardkriterier
• blodkemiparametre
• grundlæggende metabolisme ved hjælp af indirekte kalorimetri;
• biokemiske parametre, der bestemmer det metaboliske syndrom (HDL-kolesterol, triglycerider, blodsukker);
• biokemiske parametre til forudsigelse af hepatisk steatose ved hjælp af surrogatmarkører (AST, ALT, GGT, blodplader, alkalisk fosfatase, albumin);
• blodtryk;
• samtidig hormonbehandling (væksthormonbehandling, kønssteroider og/eller l-thyroxin).

Serumopsamling Fastende blodprøver vil blive opsamlet ved standard venepunktur i BD Vacutainer® serumseparationsrør (BD - Plymouth PL6 7BP, UK) og centrifugeret ved 1900g ved 4°C i 10 minutter og ved 16.000g ved 4°C i yderligere 10 min. Supernatanterne vil blive overført til nye rør og efterfølgende frosset ved -80°C til langtidsopbevaring.

Proteomanalyse Før den proteomiske analyse vil tilstedeværelsen af ​​hæmoglobin blive evalueret med spektrofotometer Beckman Coulter® DU®730 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ved brug af Harboes direkte spektrofotometriske metode med Allen-korrektion: Hb (g/L) = (167, 2 × A415 - 83,6 × A380 - 83,6 × A450) x 1/1000 × 1 / fortynding i dH2O. Skæringsgrænsen for serum vil være 0,020 g/L.

Til den proteomiske karakterisering af serum vil en ny high-throughput omics-teknologi baseret på SomaLogic SOMAscan-platformen blive brugt. Systemet er baseret på detektion af SOMAmers (Slow Off-rate Modified Aptamers), som er aptamere former for DNA med høj affinitet og specificitet for proteinmålet. Desuden er disse aptamerer resistente over for nukleotidaseaktivitet og udviser højere affinitet end normale antistoffer. Panelet brugt i denne undersøgelse vil give os mulighed for at evaluere 1500 proteinmål, der er involveret i udviklingen af ​​metaboliske sygdomme, er en del af det generelle inflammatoriske respons og er af interesse i studiet af hjerte-kar-sygdomme og også i onkologi.

Generelt er testens følsomhed og ydeevne sammenlignelig med den for et normalt ELISA-kit, med grænser for kvantificering omkring 100 fM og detektion på 40 fM, og behovet for kun 65 µL af prøven.

Validering Valideringen af ​​2 markører udvalgt baseret på signifikansen og differentialekspression mellem grupperne vil blive valideret ved hjælp af ELISA-metoden. I denne fase vil hver markør blive valideret ved at bestemme dens koncentration i serum af 60 forsøgspersoner (inkluderet i opdagelsesfasen) og i andre 32 komplementære forsøgspersoner for at nå den prøvestørrelse, der er nyttig til at opnå en passende statistisk signifikans.

Ydermere vil eksperimenterne blive sat op til at inkludere positive og negative kontroller og kontroller til at kontrollere for inter-plade variabilitet, som krævet af ELISA assay opsætningsprocedurer. Standardkurver vil blive beregnet for at bestemme den absolutte kvantificering af markørerne af interesse i serum.