Splicing do Canal de Sódio em Ensaio de Insuficiência Cardíaca (SOCS-HEFT)

Antecedentes Científicos e Significado

Introdução:

A insuficiência cardíaca congestiva (CHF) representa uma grande preocupação de saúde nos Estados Unidos. Estima-se que aproximadamente 5 milhões de pacientes nos EUA tenham ICC e cerca de 550.000 pessoas são diagnosticadas com esta doença anualmente.1 Sabe-se que a morte súbita cardíaca ocorre mais frequentemente no contexto de cardiopatia estrutural. Além disso, o risco de morte súbita cardíaca é 6 a 9 vezes maior na população com insuficiência cardíaca, e as arritmias cardíacas são talvez a principal causa de morte em pacientes com ICC. 2,3 Atualmente, tanto o American College of Cardiology quanto a American Heart Association endossam a colocação de cardiodesfibriladores internos (CDIs) em pacientes com cardiomiopatia isquêmica, expectativa de vida razoável e fração de ejeção reduzida abaixo de 40% (classe I, nível de evidência A).4 Além disso, a colocação de CDI é recomendada em pacientes com cardiomiopatia não isquêmica que atendem a requisitos semelhantes com uma fração de ejeção inferior a 35% (classe I, nível de evidência B).4 Apesar dessas recomendações para prevenção primária de morte por meio de implante de CDI, é provável que mais da metade dos pacientes que recebem um dispositivo não sofram um evento arrítmico que exija a administração de choque do CDI.3 Os dispositivos ICD, em média, custam $ 20-50.000 sem custos operacionais e de acompanhamento. Atualmente, a estratificação de risco de morte súbita cardíaca e a necessidade de colocação de CDI dependem essencialmente da avaliação da fração de ejeção do ventrículo esquerdo. Outros métodos empregados para a estratificação de risco são eletrocardiograma de sinal médio (ECG) e outra técnica eletrocardiográfica conhecida como alternância de onda T. Embora esses métodos sejam aprovados pela FDA para previsão de risco de morte cardíaca, essas técnicas não são amplamente empregadas nos EUA devido aos custos de equipamento e pessoal para implementá-las. Assim, testes alternativos para avaliação de risco para o desenvolvimento de morte súbita cardíaca na população com insuficiência cardíaca são desejáveis.

Papel dos Canais de Sódio e do Gene SCN5A:

O canal cardíaco de sódio dependente de voltagem (Na+), SCN5A, é o principal canal gerador de corrente para a propagação elétrica no músculo cardíaco e é o alvo de muitas drogas antiarrítmicas. A expressão defeituosa do canal cardíaco de Na+ resulta em aumento do risco arrítmico, conforme evidenciado pela morte súbita na Síndrome de Brugada.5 As mutações SCN5A também foram implicadas na síndrome do QT longo hereditária, que pode resultar no desenvolvimento de disritmias fatais, como fibrilação ventricular e torsades de pointes.6 Além disso, mutações no gene SCN5A também foram propostas e aumentam o risco de arritmias induzidas por drogas.7 Muitos estudos foram feitos para esclarecer o papel desse canal de sódio insensível à tetrodotoxina em estados de doença. Foi demonstrado que os canais de sódio mutantes na cardiomiopatia dilatada podem funcionar de maneira diferente, dependendo do tipo de mutação específica da subunidade alfa do canal de Na+ principal.8 Especificamente, Nguyen et al demonstraram que essas mutações podem levar a alterações na função fisiológica, como tempo de aumento do potencial de ação mais lento, aumento da corrente tardia de sódio durante o estado estacionário ou inativação prejudicada.8 Mutações adicionais no gene SCN5A foram associadas a mudanças na dependência de voltagem da inativação do canal de Na+ em pacientes com fibrilação ventricular idiopática.9 Pesquisas adicionais concluíram que a diminuição da inativação das correntes tardias de sódio pode contribuir para o prolongamento do potencial de ação.10 Foi demonstrado que uma anormalidade diferente do gene SCN5A, a mutação E161K, leva à diminuição da densidade da corrente de sódio e a um deslocamento positivo de 11,9 mV na metade do potencial de ativação máximo da membrana celular.11 Portanto, as mutações do canal de Na+ podem causar comportamento alterado do canal e arritmias.

Valdivia et ai. demonstrou que a densidade de pico de corrente de sódio é reduzida em 39% no modelo canino e aproximadamente 57% em corações humanos explantados com falha, embora o mecanismo não seja claro.10 Embora nossa compreensão das alterações eletrofisiológicas na insuficiência cardíaca e sua relação com a arritmogênese permaneça obscura, pode-se inferir que as interrupções no manuseio do sódio - e talvez o aumento do sódio intracelular - também podem resultar em alteração na homeostase do cálcio por meio da ação do trocador Na+/Ca2+. 12,13 No geral, essas alterações no INa provavelmente contribuem significativamente para a arritmia no cenário de insuficiência miocárdica.

No nível do genoma, a pesquisa se concentrou no papel das mutações do gene SCN5A na arritmogênese.8,9,14-16 No entanto, recentemente descrevemos defeitos adquiridos no RNA mensageiro (mRNA) do canal de Na+ que resultam em redução da corrente de Na+ e ocorrem apenas em corações falidos. Três variantes de splicing de mRNA SCN5A 3'-terminal foram identificadas e caracterizadas em ventrículos cardíacos humanos falidos. Previu-se que essas variantes de splicing resultariam na tradução de canais iônicos de sódio não funcionais que carecem de uma região de poro de domínio IV apropriada. Essas três variantes de splicing para o produto gênico do canal de sódio não funcional foram denominadas E28B, E28C e E28D. Os níveis relativos da isoforma de mRNA de comprimento total, E28A, foram reduzidos em 24,7% em pacientes com ICC em comparação com o controle. Além disso, duas versões truncadas do produto gênico foram aumentadas em pacientes com insuficiência cardíaca, refletindo uma anormalidade genética adquirida na produção do gene SCN5A na insuficiência cardíaca. Ao mesmo tempo, as abundâncias de mRNA de E28C e E28D aumentaram 14,2 vezes e 3,8 vezes, respectivamente, em pacientes com CHF em comparação com os controles. A fim de confirmar que as variantes de truncamento poderiam contribuir para o risco arrítmico, um modelo de camundongo gene-alvo foi criado com uma mutação sem sentido no exon 28. O efeito eletrofisiológico da presença deste gene truncado também foi examinado. Verificou-se que a taxa de aumento do potencial de ação foi reduzida (p = 0,02, n = 11), e a amplitude do potencial de ação foi reduzida de 76 ± 1,4 mV para 52 ± 0,6 mV (p≤0,01, n=11). O efeito integrado desse truncamento foi estudado examinando-se os potenciais de campo bipolar (PF) de cardiomiócitos em arranjos de microeletrodos.17 Foi observada uma redução de 70,5% (p<0,05) de -1126 ± 314 μV (n=6) no WT para 332 ± 174 micro V (n=7) na amplitude do FP. Medições adicionais feitas por este método revelaram um atraso no aumento de FP e velocidade de condução lenta nas células mutantes versus controles normais, sugerindo que os mutantes de truncamento podem causar anormalidades elétricas graves o suficiente para contribuir para o risco de arritmia. Além disso, mostramos que os linfócitos processam os canais de sódio de forma semelhante aos cardiomiócitos. Assim, o processamento do mRNA do linfócito SCN5A pode servir como um marcador substituto para avaliar o SCN5A no nível cardíaco e pode estar correlacionado com o risco arrítmico em populações de alto risco. Este estudo avaliará essa afirmação.

Metas/Objetivos Específicos:

Objetivo de pesquisa 1:

Determinar a abundância de variantes de splicing de mRNA de SCN5A em pacientes com ICC e frações de ejeção de linha de base inferiores a 35% versus controles normais de faixas etárias semelhantes.

Objetivo de pesquisa 2:

Comparar a abundância de variantes de splicing de mRNA de SCN5A em pacientes com dispositivos de CDI que receberam e não experimentaram terapia de choque de CDI.

Locais de Pesquisa de Desempenho:

Centro Médico da Universidade de Illinois e Centro Médico Jesse Brown VA.

Pessoal-chave da pesquisa:

O Investigador Principal deste estudo será o Dr. Samuel Dudley, MD, PhD. Dr. Dudley é o Chefe da Seção de Cardiologia da Universidade de Illinois em Chicago. Ele é professor de medicina e autor publicado no campo da medicina e fisiologia cardiovascular.

Métodos de pesquisa:

Design de estudo:

Objetivo da pesquisa 1: Correlacionaremos a quantidade de variantes de splicing do canal de Na+ nas células brancas com a fração de ejeção em pacientes com e sem insuficiência cardíaca.

Objetivo da pesquisa 2: Correlacionaremos a quantidade de variantes de splicing de canais de Na+ de glóbulos brancos com o número de choques de CDI apropriados em pacientes com CDIs implantados.

Intervenções do Estudo:

Este estudo não requer nenhuma mudança no padrão de atendimento. Todos os participantes do estudo serão submetidos a flebotomia no momento da inscrição.

Coleta e processamento de amostras:

Cerca de 15 ML de sangue serão coletados dos participantes do estudo da Universidade de Illinois em Chicago (UIC) ou Centro Médico de Assuntos de Veteranos Jesse Brown (JBVAMC) que deram consentimento informado para flebotomia e participação no estudo. As amostras serão entregues imediatamente pela equipe do estudo (coordenador, CO-PI, etc) ao laboratório do Dr. Dudley (PI) na sala 1133 do Edifício de Ciências Clínicas (CSB) para processamento dentro de 2 horas após a coleta. Os níveis de mRNA serão medidos e parte da amostra processada pode ser armazenada em um freezer de -80° F no mesmo laboratório por até 7 anos. As amostras NÃO serão armazenadas ou processadas no JBVAMC ou em qualquer outra instalação.

Considerações estatísticas:

A relação das abundâncias variantes do mRNA do canal de Na+ será comparada em indivíduos com e sem insuficiência cardíaca e em indivíduos com e sem eventos de CDI. O endpoint primário será a comparação das abundâncias de variantes de mRNA. As variáveis ​​dependentes incluirão insuficiência cardíaca para o objetivo 1 e o número de choques no objetivo 2. O número de pacientes necessários para cada objetivo é determinado pela variância do teste, a diferença média esperada e algumas considerações sobre o número de covariáveis ​​que precisarão a analisar na análise de regressão. Anteriormente, mostramos que a medida menos sensível era uma redução na abundância de E28A em 24%. Se assumirmos que a mesma redução percentual acontecerá nas metas 1 e 2, precisaríamos de cerca de 45 pacientes em cada grupo para ter 90% de poder para detectar essa diferença, assumindo uma taxa de perda de 10% devido a erros técnicos nos ensaios . Portanto, precisaríamos de um total de 180 pacientes para o estudo total, 45 com insuficiência cardíaca, 45 controles, 45 pacientes com CDI com eventos e 45 pacientes sem eventos.

Os dados da linha de base serão expressos como média ± desvio padrão (DP) para variáveis ​​contínuas e frequências para variáveis ​​categóricas. As diferenças nas características basais entre os grupos serão examinadas pelo uso dos testes exatos de Fisher e Mann-Whitney para variáveis ​​categóricas e contínuas, respectivamente. Como o número de eventos ICD registrados é uma função do tempo de observação, a regressão de Poisson será usada para modelar qualquer relação. Neste modelo, assume-se que o número de eventos de ICD observados segue uma distribuição de Poisson. Ou seja, para um determinado período de tempo, a probabilidade de que um certo número de eventos tenha ocorrido é uma função da taxa de eventos multiplicada pela duração da observação. Para estimar os efeitos das variantes de mRNA na taxa de ocorrência de eventos, assume-se que a taxa de eventos é log linear em relação aos preditores de interesse. A solução dessa equação fornece taxas de taxas comparando a taxa de ocorrência de eventos em indivíduos com e sem eventos de CDI. Expressões múltiplas para as abundâncias variantes de mRNA serão consideradas, como a abundância relativa de cada variante individualmente, a abundância da variante individual em função do mRNA do canal de Na+ total e a razão dos truncamentos para o canal de Na+ completo mRNA. O coeficiente de regressão será estimado para a relação entre a variável dependente, eventos de CDI e as variáveis ​​independentes como o logaritmo das estimativas de razão de taxas. A significância estatística será determinada por meio do teste de razão de verossimilhança. Um valor p de 0,05 ou menos será considerado estatisticamente significativo. Os resultados serão relatados como a razão de risco e seu intervalo de confiança de 95% associado. Para selecionar as variáveis ​​a serem incluídas no modelo, consideraremos, de forma conservadora, aquelas variáveis ​​com distribuição diferente entre os dois grupos a um p<0,20. A possibilidade de multicolinearidade será avaliada. Serão considerados termos lineares e não lineares. A normalidade das distribuições das variáveis ​​será testada por um gráfico de probabilidade normal e por um teste de Shapiro-Wilk. Embora a regressão seja bastante tolerante a violações a esse respeito, as transformações serão investigadas conforme necessário. A homocedasticidade será avaliada pelo gráfico de resíduos versus valores preditos. A discriminação do modelo será avaliada por um índice C geral e validada por métodos bootstrap.

Resultados esperados e armadilhas:

Não prevemos complicações com a aquisição de amostras de sangue, análise de variantes de mRNA ou realização de estatísticas. No entanto, a principal limitação deste estudo é sua natureza retrospectiva. No entanto, esses dados serão úteis no desenho de futuros estudos prospectivos.